文献解读 | Science：仅13天！科学家利用胚胎干细胞在体外成功构建「3D重组卵巢体」

生殖细胞是通过减数分裂的特殊形式制造出来的，卵母细胞的形成方法名为卵母细胞生成。在早期的胚胎发育中，原始生殖细胞转移至生殖嵴后转化为卵原细胞，并与体细胞结合，在减数分裂中发育为卵母细胞。而生殖嵴也随之发育为性腺，为卵原细胞提供生长信号，伴随着颗粒细胞和间质细胞的分化，卵泡结构最终形成。

因此，生殖细胞的发育是一个精密而又复杂的过程，人们也在这奇妙的发育过程中不断进行着探索。2021年7月，日本九州大学的吉野隆史及其团队在 Science 发表了题为 Generation of ovarian follicles from mouse pluripotent stem cells 的论文，该研究报道了一种体外构建重组卵巢体的培养体系，并使用该卵巢体成功在体外环境促进卵母细胞成熟，形成卵泡结构。

该团队此前便致力于生殖细胞发育的研究，于2012年和2016年分别开发了在体内和体外使用胚胎细胞通过诱导使其发育为卵母细胞的培养体系。而在2021年更进一步，体外构建卵巢体，为细胞发育的研究提供新的模型和培养思路。

为了评估最适的培养条件，首先，作者针对性腺体细胞前体，中间中胚层（IMM）细胞的Pdgfra进行标记探测，使用TGFP荧光标记的诱导分化的上胚层样细胞在进行培养。在添加BMP4和WNT激动剂CHIR99021的不同浓度组合的培养结果中，作者发现上胚层养细胞在培养第二天后的消失，以及Pdgfra在培养第四天后的持续存在，这一现象表明了细胞分化的发生。（图1）

图1. TGFP和Pdgfra标记在细胞培养中的变化

随后，作者通过使用Foxf1 tdTomato/Osr1-GFP报告ESCs（图S3A），监测中间中胚层（IMM）标记Osr1和侧板中胚层（LPM）标记Foxf1的表达，发现二者同时受到BMP4和CHIR99021的计量调控。不同于Foxf1在高浓度BMP4中的大量表达，Osr1受CHIR99021的高浓度诱导，却随BMP4的浓度升高而下调。考虑到在这两种因子调控下，近轴中胚层（PM）细胞无法生长，而IMM与LPM细胞被互斥调控，为了获得大量的IMM细胞，作者将BMP4和CHIR的浓度分别固定在1 ng/ml和14 μM。（图2）

图2. 两种因子对IMM和LPM细胞的互斥调控

接着，为了进一步诱导IMM样细胞向生殖嵴分化，作者添加了中胚层的前移介导因子视黄酸（RA），上胚层特化因子音猥因子（SHH），以及FGF抑制剂PD0325901（PD）以抑制后移发生。通过使用绿色荧光蛋白（GFP）和增强型青色荧光蛋白（ECFP）对IMM标记Osr1和生殖嵴标记Gata4进行追踪。FACS分析和Q-PCR显示三种因子均能有效促进Gata4 CFP阳性/Osr1-GFP低表达细胞，即向生殖嵴分化的中胚层细胞的数量，作者将RA、PD和SHH的浓度分别设定在3mM、1mM和30ng/ml，用于后续培养实验。（图3）

图3. 卵巢体体外培养体系的确定

为了进一步探究生殖嵴细胞的体外发育程度，作者选用了Nr5a1这个在所有生殖嵴所有细胞谱系中均有表达的标记基因进行更加严格的把控。作者从Nr5a1-hCD271细菌人工染色体转基因小鼠中获得了雌性胚胎干细胞（ESC），同时又以tdTomato标记颗粒细胞标记基因Foxl2，并在上述培养条件下成功在第4天观察到Nr5a1阳性细胞，随后又在第6天检测到Foxl2阳性细胞的出现。这一现象证明了生殖嵴的成功分化以及颗粒细胞的产生。考虑到体内胚胎细胞发育到颗粒细胞的产生需约6.75天，体内外细胞生长周期基本一致。（图4）

图4. 标记基因显示生殖嵴与颗粒细胞的成功发育

对于所获细胞群，作者对通过MACS分选的Nr5a1-hCD271阳性细胞进行了单细胞RNA测序分析。通过将培养第6天的细胞与体内E10.5至E14.5胚胎性腺中的细胞进行比对，证明所获培养物与体内E11.5到E14.5的细胞基因表达谱类似，而表达基因也显示了卵母细胞成熟过程中的关键细胞存在。进一步，通过Nr5a1分选细胞，将所获细胞进行再次聚类，获得表达基质细胞，颗粒细胞，以及生殖祖细胞的6大细胞类群。（图5）

图5. 培养物中的细胞类群

而通过与体内细胞发育进行比对，证明了细胞成分的一致性，因此，作者将Nr5a1-hCD271阳性细胞命名为胎儿卵巢体细胞样细胞（FOSLCs）。为了验证所获FOSLCs的功能，作者将其与小鼠多能干细胞来源的原始生殖细胞样细胞（PGCLC）按照体内比例进行混合，在体外分化培养条件（IVD）下进行培养，最终观察到卵母细胞的产生，因为作者构建的FOSLCs聚集成球体并能够促进卵母细胞成熟，作者将其命名为重组卵巢体。通过以E12.5期的小鼠性腺体细胞作为对照，以BVSC作者观察到重组卵巢体的卵母细胞形成数量有所下降，但是形成率率达到了100%。（图6）

图6. 卵母细胞在重组卵巢体中的形成

而进一步地，FOSLC 的发育能力通过体外生长培养 (IVG) 得到进一步验证。在 IVG 培养中，FOSLC 衍生的颗粒细胞增殖并于 D12 形成卵丘-卵母细胞复合体 (COC)，并形成跨透明带结构 (TZP)，这对于支持卵母细胞生长的近分泌相互作用至关重要。而在体外成熟培养（IVM）条件下，FOSLC衍生的卵丘细胞被扩增，这在卵丘细胞成熟过程中通常可以观察到。随后，28.4%（33/116）的分离卵母细胞随着第一极体的挤压进入MII（第二次减数分裂阶段）阶段，并与体内发育数据一致。最后，作者对所获卵母细胞进行体外受精，并移植入雌鼠体内，镜下观察发现了受精卵的分裂，而亲代与子代均能够正常孕育后代。（图7）

图7. 卵丘，透明带的形成与生殖细胞的发育

在这项研究中，作者通过完善体外条件，成功构建出能够模拟体内卵巢细胞组成及功能的重组卵巢体，并使用该模型成功诱导原始生殖细胞的分化，并且，形成的卵母细胞也具有孕育后代的能力，显示了卵巢体在一定程度上的完整性以及对体内环境的高度模拟性。

这项研究使得人们在后续的发育生物学研究中无需从诱导性多能干细胞起始，减少了实验周期，为胚胎性腺体细胞提供了新的来源。体外卵巢体为发育生物学研究以及体外细胞培养，模型构建提供了新思路，并可能成为体外培养的一块全新的拼图。而该模型是否能够长期重复使用，并打破遗传的限制，也使科学家对此产生了新的期待。

▍以上内容来自伯桢生物编辑部