肿瘤分子分型专辑 | Cell：中国人群的HBV相关肝细胞癌研究
编者按：
肿瘤分子分型：通过NGS、蛋白质组等组学技术，对肿瘤进行分子谱的系统描绘，并根据分子特征谱，进行肿瘤的精准分类及精准诊疗研究。
分子分型已成为国家精准医疗战略的重点研究投入方向；也备受CNS顶刊杂志青睐。
为了帮助广大临床研究者了解肿瘤分子分型及诊疗研究的重大前沿进展，我们收集整理了近几年来发表于Cell、Nature、Cancer Cell等顶刊上的，基于蛋白质组及蛋白基因组的肿瘤分子分型相关研究论文。
【肿瘤分子分型专辑】为大家精细解读重磅研究与进展。
【癌种】：肝癌
【细分癌种】：HBV感染肝细胞癌（HBV-HCC）
【地域】：中国大陆
【通讯单位】：复旦大学附属中山医院
【发表时间】：2019年
【涉及组学】：全外显子、转录组、蛋白组、磷酸化修饰蛋白组
【文献出处】：DOI:https://doi.org/10.1016/j.cell.2019.10.038
主要成果
1. 从蛋白质组水平定义了新的HBV-HCC分型，该分型能够进行预后分层及治疗分类
2. 系统鉴定了HBV-HCC的肝脏特异性蛋白组和代谢过程的变化
3. 系统描绘了HBV-HCC的关键信号与代谢通路的多组学图谱
4. 发现了CTNNB1 突变相关的ALDOA磷酸化对HCC细胞增殖的促进作用及机理
疾病背景
【流行病学】：肝癌是全球癌症相关死亡的第四大主要原因。肝细胞癌（HCC）占所有原发性肝恶性肿瘤的约85％–90％，主要为乙型肝炎病毒（HBV）和丙型肝炎病毒（HCV）的慢性感染，以及酗酒和代谢综合症。目前的抗病毒疗法只能降低而不能消除HBV，据估计全球HBV感染人数为292,000,000。值得注意的是，HBV相关的HCC约占中国HCC病例的85％。
【主要驱动基因】：TP53，CTNNB1，TERT promoter
研究设计
【主要样本】：HBV-肝细胞癌病人经手术切除的癌组织 VS 癌旁组织
【样本状态】：新鲜冰冻
【样本数量】：158 paired
【治疗干预】：手术前未经放化疗等干预
【主要研究路线与内容】：
1. 单组学分析：
组别：癌 VS 癌旁
WES：基因拷贝数、基因突变；（1）中国人群HBV特有突变；（2）马兜铃酸相关特有突变
TMT蛋白组：蛋白鉴定与定量数量；蛋白组与mRNA相关性分析
TMT磷酸化蛋白组：修饰蛋白、修饰肽段鉴定与定量数量
2. 整合分析：
主要研究结果
一、多组学检测结果的统计
二、基因突变情况
1. 主要有5个显著的突变基因：TP53 (58%)、CTNNB1 (19%)、AXIN1 (18%)、KEAP1 (7%)、和RB1（6%）
Genetic profile and associated clinicopathologic features of all the 159 HCC patients
2. 中国人群的HBV-HCC特有突变特征，通过与TCGA数据比较：AXIN1、TSC2、 smARCA2等突变频率更高，而CTNNB1、ARID1A、RB1突变频率略低。
Comparisons of frequently mutated genes between CHCC-HBV cohort and TCGA HCC cohort
3. 马兜铃酸相关突变：被认为是肝癌的诱导因素，而且中国HBV肝癌人群中预计有80%以上使用过马兜铃酸相关药物进行肝炎的治疗，因此进一步分析了马兜铃酸相关突变：（1）马兜铃酸主要诱导A:T >T:A转变；（2）马兜铃酸相关肿瘤比非肿瘤，具有更高的肿瘤突变负荷（TMB）及预测的新生抗原数；（3）马兜铃酸相关肿瘤具有更多的免疫细胞侵入，及更高的免疫调控蛋白表达。
Comparisons of TMB and predicted neoantigens in tumors with and without AA signatureComparisons of CD8+ T cells and immune regulatory molecules in tumors with and without AA signature
结论
鉴定了中国人群HBV-HCC的主要基因突变；同时鉴定了广泛使用的马兜铃酸所诱导的基因突变情况，并提示该类病人接受免疫治疗获益的可能性。
三、HBV-CC的蛋白基因组分析：基因拷贝数变化（CNA）与mRNA/蛋白/磷酸化的表达关联
1. CNA的cis & trans调控：cis调控是指，A基因变化调控A基因的mRNA、蛋白与磷酸化变化；trans调控是指，A基因变化影响B基因等其他基因的mRNA、蛋白与磷酸化变化。如果基因突变或基因拷贝数的变化，与蛋白、磷酸化修饰的表达的不一致性，可能是部分基因指导效果不理想的原因之一。
Correlations of CNA (x axes) to mRNA (left) and protein (right) expression (y axes) with CNA cis and trans effects
2. CNA的cis调控：
（1）具有cis调控作用的基因比例：CNA-mRNA（48%）、CNA-protein（46%）、CNA-磷酸化（30%）
（2）CNA-mRNA的相关性（中位数仅0.33）>CNA-protein的相关性（中位数仅0.21）；19.5%的基因存在CNA-mRNA到protein的表达断层；这些断层多属于蛋白复合体（如ribosome and spliceosome）相关蛋白，可能因为与翻译后修饰及蛋白半衰期有关。
Scatterplot of CNA correlation to mRNA and protein
3.CNA的trans调控：
（1）具有trans调控作用的基因比例：CNA-mRNA（72%）、CNA-protein（44%）、CNA-磷酸化（28%）
（2）主要deletion主要存在于染色体4q and 16q，并同时存在mRNA-蛋白的负相关表达；这些负相关与泛素化调控有关，例如泛素化对细胞周期的调控。
Venn diagrams of mRNAs/proteins with negative CNA-mRNA and CNA-protein correlations in chromosomes 4q
Enrichment analysis of proteins with negative CNA-protein correlation in chromosomes 4q
Heatmaps of copy-number loss of chromosomes 4q and the mRNA(m)/protein(p) abundance of UPS and cell-cycle-related proteins
结论
与已报道的其他研究结果相近，基因拷贝数变化与蛋白表达变化仅具有部分相关性，整体相关性较低。因此，肿瘤相关的基因信息，需要结合蛋白质的结果做进一步的确认与应用，可能是基因指导的诊疗需要注意的。
四、基于蛋白质组的肿瘤分型分析：
1. 基于蛋白组的肿瘤分型：对肿瘤组织中异常表达的蛋白进行非监督的聚类分析，共鉴定到3个肿瘤亚型：代谢型（S-Mb）、微环境失调型（S-Me）、增殖型（S-Pf）。主要突变基因RB1与TSC2富集于S-Pf 和S-Me型；病理相关指标，如肿瘤大小、癌栓、晚期TNM分期，集中于S-Pf型；S-Mb型的基因组相对更稳定；S-Mb型具有最高的TMB和新生抗原预测，可能从免疫检查点阻断治疗中获益。
Patient subgrouping based on differentially expressed proteins
2. 分型的预后分析：
（1）三个肿瘤亚型的生存率存在显著差异，并且是独立于AFP、肿瘤大小、癌栓、 BCLC分型与TNM 分期的预后因子。
（2）根据TNM分期对患者进行分层，无论肿瘤分期如何，蛋白组亚型仍与患者的预后密切相关。利用本蛋白组特征对TCGA HCC mRNA数据进行分类，其生存差异与本研究相似。
（3）对于肝癌最重要的病理特征—癌栓：与癌栓有关的蛋白有82个，包括参与代谢重编程、过氧化物酶体和肝功能。
The heatmap (E) and enriched pathways (F) of significantly differential expressed proteins in tumors with or without tumor thrombus
结论
蛋白质组能够对HBV-HCC进行亚型分类，不同亚型具有不同的分子、病理等特征。基于蛋白质组的各亚型存在显著的生存差异，从而支持了蛋白质组分子特征具有的优越预后能力。
五、预后标志物筛选和验证：
1. 标志物筛选：基于严格的多维度的筛选，选择了2个具有亚型表达特征的潜在预后标志物—PYCR2和ADH1A。
Workflow for selecting prognostic proteins. Relative abundance of PYCR2 and ADH1A between tumor and non-tumor tissues (t test) as well as across proteomic subgroups
2. 潜在标志物具有明显的生存差异分层：组织微阵列的免疫组化显示，其确实存在肿瘤组织特征表达。
Kaplan-Meier curves for overall survival based on proteomic abundance (n = 159; solid lines) or immunostaining scores
Representative multiplex immunostaining images of PYCR2 and ADH1A on tumor and paired non-tumor liver tissues
3. 预后标志物验证：243例病人的队列进行标志物预后能力的独立验证
Kaplan-Meier curves for overall survival based on immunostaining scores of PYCR2 and ADH1A in an independent HCC cohort
4. 预后标志物相关的多组学分子表达、功能与病理情况：例如PYCR2高表达的患者表现出显著的癌栓、更大的肿瘤体积和更多的TP53或TSC2突变，以及多属于晚期TNM阶段。功能方面，代谢和过氧化物酶体相关的途径下调，而DNA复制、RNA转运和错配修复相关的功能上调。
Associations of PYCR2 (F) expression with proteomic subgroups, clinicopathologic factors, and multi-omics profiles
结论
利用蛋白质组，发现了2个预后标志物，且标志物的表达水平与相关的分子及病理有显著相关性。
六、解析HBV相关蛋白与肝特异性蛋白组：
1. HBV相关蛋白：（1）在蛋白质组学和RNA-seq数据中均检测到大包膜蛋白，外部核心抗原/衣壳蛋白和聚合酶蛋白，而仅在RNA-seq数据中检测到X蛋白；（2）有意思的是，在蛋白和mRNA水平，HBV蛋白及其受体SLC10A1均在肿瘤组织中表现出更低的表达，尤其是在S-Me、S-Pf型中。并且SLC10A1表达越高，预后越好。
Expression of HBV viral proteinsExpression of HBV viral mRNAs (C, n = 14; E, n = 72; P, n = 155; S, n = 69; X, n = 153, t test)Expression of SLC10A1 proteinKaplan-Meier curves for overall survival based on proteomic abundance or immunostaining scores of SLC10A1 in the current cohortKaplan-Meier curves for overall survival based on immunostaining scores of SLC10A1 in an independent HCC cohort
2. 胆汁酸代谢： SLC10A1是一种肝特异性蛋白，主要起胆汁酸转运体的作用。进一步研究发现，FXR、RXR功能受损所导致的胆汁酸代谢及HBV基因表达的抑制，是HBV-HCC的独特分子特征。
Integrated analysis of key transcriptional factors, enzymes, and transporters in bile acid metabolism
3. 肝脏蛋白质组：在检测到的肝特异性蛋白中，有80.3％（290/361）在肿瘤中下调，并且肝特异性代谢途径中的大多数蛋白在肿瘤中显著减弱。但是，胆固醇合成关键酶SOAT1 / SOAT2则在S-Me和S-Pf亚型中上调，表明在更多的增生性肿瘤中，脂肪酸-胆固醇酯的合成代谢得到增强。GLS / GLUD2在S-Me和S-Pf中也显示较高的表达，表明谷氨酰胺代谢可能在此类肿瘤中更活跃，以满足其能量需求。
Differential expression of the liver-specific proteins among the three proteomic subgroupsHeatmap and quantitative analysis of differentially expressed proteins in the liver-specific functions
结论
描绘了HBV-HCC的肝脏特异性代谢的整体重编程。
七、描绘代谢通路与信号通路变化：
将mRNA、蛋白、磷酸化多个分子层面的数据进行整合，分别对整体水平、亚型和关键驱动基因的代谢和信号通路进行分析，发现：
1. 代谢通路方面：（1）糖酵解相关代谢酶增强，但TCA循环与氧化磷酸化的改变不完全协同；（2）脂质合成相关酶增强；（3）胆固醇-胆汁酸代谢酶功能失调。
2. 信号通路方面：HCC相关信号如WNT、 Hippo-Yap、mTOR 已有较多研究，但本研究在临床队列水平上，进行了系统的蛋白与磷酸化分析。
Overview of metabolism and signaling pathways based on integrated proteogenomic analysis
3. 亚型的通路特征方面：S-Mb型富集于TCA循环、脂肪酸-脂质代谢等，表现出代谢特征；S-Pf型富集于细胞增殖信号，表现出最前高的细胞再生活性；S-Me型具有较少的通路改变，表现出代谢与信号通路富集的混合状态。
Integrated analysis of differentially activated metabolic and signaling pathways
4. TP53突变相关：在蛋白水平上，主要富集于代谢、细胞周期和DNA修复方面。但在磷酸化修饰水平上，却没有明显的富集，说明TP53可能存在广泛、复杂的通路机理。
Pathway enrichment analysis based on differentially expressed proteinsHeatmap represents protein phosphorylation sites
5. CTNNB1突变相关：主要富集于药物代谢、糖酵解糖异生、氨基酸代谢等代谢通路，包括关键代谢酶ALDOA和ENO1的磷酸化增强。说明CNTTB1与肝癌异常代谢重编程相关。
Pathway enrichment analysis based on differentially expressed proteinsHeatmap represents protein phosphorylation sites
结论
在临床队列水平上，系统描绘了HBV-HCC的代谢与信号变化，其中不同亚型具有不同的代谢与信号通路特征。并进一步关注了重要驱动基因的相关代谢调控与信号通路。
八、关键驱动基因CTNNB1的新分子机理与功能：
CNTTB1是HCC的关键驱动基因，被发现与代谢调控有关，但其具体的分子机理尚不清楚。上述研究发现ALDOA Ser36位磷酸化在CNTTB1突变肿瘤样本中有异常高表达（而蛋白水平则轻微低表达）。因此进一步进行了ALDOA Ser36位磷酸化与CTNNB1调控HCC代谢的及研究：
1. 细胞实验：利用细胞外酸化、细胞增殖实验，证实ALDOA Ser36E磷酸化激活，影响肝癌细胞代谢与细胞增殖；进一步，ALDOA knockdown减少了CNTBB1对增殖的促进作用
2. 动物实验：发现ALDOA-S36E磷酸化激活细胞，形成更大的肿瘤体积。
结论
ALDOA相关代谢酶的磷酸化激活，介导了CTNNB1突变HCC的代谢重编程及细胞增殖。
总结
该研究使用配对的肿瘤和来自159名患者的相邻肝组织进行了乙型肝炎病毒（HBV）相关的肝细胞癌（HCC）的首次蛋白质组学表征。
（1）整合的蛋白质组学分析显示，在HBV相关的HCC中，关键信号通路的激活状态以及肝脏特异性代谢重编程之间存在一致性和不一致。
（2）蛋白质组学分析确定了与临床和分子属性相关的三个亚型。这些蛋白质组亚型在代谢重编程、微环境失调、细胞增殖和潜在的治疗方法中具有独特的特征。
（3）研究鉴定了两个预后生物标志物PYCR2和ADH1A，它们与蛋白质组特征有关并且参与了HCC代谢重编程。
（4）揭示了CTNNB1和TP53突变相关的信号和代谢谱，其中CTNNB1突变相关的ALDOA磷酸化，被证实可促进代谢重编程和细胞增殖。
该研究研究提供了宝贵的资源，可极大地扩展与HBV相关的HCC的知识，并可能最终有益于临床实践。
