8月2日晚佩洛西窜访台湾，所乘专机按时落地抵达松山机场，那一晚大多数人估计都跟小云一样心里憋着一口气，说不出来的憋屈呀。

看到此景，心中只有一个想法，那就是我们必须变得更强大，祖国大好青年要在自己的岗位上发光发热，给自己加油打气！

不管怎样，还是要做好本职工作，所以新的一天，小云又开始给朋友们发掘新的生信分析思路了，这回就讲讲上次铁死亡直播中大家问的比较多的“非肿瘤疾病铁死亡思路”。

这次推荐的文章看起来简简单单，但细看分析思路又觉得画风有些清奇，跟常规思路有那么一点不同，不过能发到8分+Frontiers上也是个性价比超高的思路，不给大家分享一下小云都觉得亏了。下面一起来看看吧，如果你关注的疾病方向也有合适数据，抓住机会赶紧上车，这波不亏！

小云公众号持续为大家带来最新生信思路，更多铁死亡分析思路推荐：

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研究背景

儿童脓毒症的早期诊断对于降低死亡率至关重要，铁死亡可能在脓毒症的发生发展中起重要作用，但很少有研究关注铁死亡相关基因在脓毒症早期诊断中的价值，尤其是在儿童脓毒症中的价值。

数据来源

主要结果

1. 脓毒症与对照之间铁死亡相关 DEG 的鉴定

使用“limma”软件包分析来自脓毒症儿童和正常对照的全血 RNA 样本中的 DEG，与从“FerrDb”数据库中 提取的铁死亡相关基因取交集，共获得34 个铁死亡相关DEG。

图1 脓毒症儿童和对照组差异表达的铁死亡基因的鉴定

2. 铁死亡相关DEG的富集分析和PPI网络分析

使用 R 的“clusterProfiler”包对铁死亡相关的 DEG 进行GO和KEGG富集分析。使用 STRING 在线网站对铁死亡相关的 DEG 进行PPI网络分析，并使用 cytoHubba 插件提取关键子网络，选择得分最高（MCC算法）的前三个基因（HMOX1、MAPK14、TLR4）作为枢纽基因。

图2 铁死亡相关DEG的富集分析和PPI网络分析

3. 脓毒症和对照之间的免疫浸润和免疫检查点基因景观

使用 CIBERSORT 算法，我们分析了脓毒症组和对照组之间外周血免疫细胞的差异。接下来，使用微阵列数据分析了脓毒症和对照之间免疫检查点基因表达的差异。

图3 儿童脓毒症和对照之间的免疫浸润和免疫检查点基因景观

4. Hub基因与免疫细胞和免疫检查点基因的相关性

通过Spearman等级检验或Pearson相关系数分析hub基因（HMOX1、MAPK14 和 TLR4）与免疫细胞和免疫检查点基因之间的相关性。

图4  hub基因与免疫细胞和免疫检查点基因的相关性

5. Hub 基因在训练集和验证集中诊断脓毒症的表现

首先分析脓毒症组和对照组中3个hub基因的表达差异。再使用受试者工作特征曲线（ROC）分析三个hub基因的诊断准确性，并表示为ROC曲线下面积（AUROC）和95％CI，计算每个基因的敏感性、特异性等。

图5 hub基因在训练集中诊断脓毒症的表现

6. 验证外部验证集中的血清 HMOX1、MAPK14 和 TLR4 浓度

收集32 名败血症患儿和 32 名呼吸道感染患儿的血液样本和临床信息作为外部验证队列，通过ELISA验证了脓毒症和对照之间血清中3种蛋白质的浓度。最后在外部验证队列中通过ROC曲线评估血清MAPK14 蛋白诊断脓毒症的性能。（小云画外音：利用ELISA检测hub基因血清蛋白表达实验做的比较少，一般还是做qPCR验证基因表达的比较多。并且还在外部验证队列中评估了血清蛋白的诊断性能，这一点也是文章比较特殊的地方，可以偷偷学起来哦）

7. GPX4 和 TFRC 在脓毒症和对照中的差异

GPX4和TFRC在铁死亡中发挥了重要作用，因此有必要分析脓毒症和对照之间的差异。首先在训练集、验证集和血清样本中检测了GPX4和TFRC的表达，随后分析了GPX4和TFRC与MAPK14的相关性。（小云画外音：由于差异分析截止值为：p 值 < 0.05 和 FC（倍数变化）> 1.5，而GPX4和TFRC不满足上述条件，所以并未被认定为DEG。但又因为GPX4和TFRC是铁死亡关键基因，这里又验证了其表达并检测了其与筛出来的hub基因的相关性，这一点又是文章的一个特殊点。即使铁死亡关键基因没有直接筛选出来，也可以在后面单拎出来进行验证并分析其与hub基因或关键预后基因等的相关性，既提高了与铁死亡的相关性，由增加了数据量，你学会了吗？）

图7 GPX4 和 TFRC 在脓毒症和对照中的差异

文章小结

经过小云的分析，大家都有发现这篇文章思路清奇的点了吗？是不是又简单又出乎意料呢？这种点就是大家可以在自己的文章思路中可以借鉴的点，很好实现又突出了创新性，何乐而不为呢？ 

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