SnapGene 入门

高中生物及格

质粒：细胞的染色体或核区DNA之外，能够自主复制的DNA分子。

质粒可以携带新的性状如抗病毒、抗药性、表达外源蛋白

质粒对正常环境下的微生物没有决定性作用

一个微生物承载过多外源质粒会带来生存劣势（消除杂菌）

接合：细菌除了分裂以外还可以进行有性生殖，该过程称为接合（性菌毛：质粒扩散）

滚环复制

分子克隆：遗传信息的复制粘贴

限制性内切酶

平末端和黏性末端

平末端：易出问题，不推荐

黏性末端：稳定，推荐

5‘黏性末端和3’黏性末端

酶：有酶，底物到产物，顺反应

无酶，产物到底物，逆反应

相比有机合成，生物合成：能耗低，纯度高

酶的机制：预存能量，按规则激发

酶的常见作用机制

胞外催化

理论上：

生命活动完全来源于酶

所有酶促反应都是化学反应

酶能否工作与生命无关

只要有相应的酶，就能在细胞外复制生命反应

只要有基因序列，就能用微生物产酶

EcoR V二聚体 遇见 DNA 松散结合

发现特异性位点 ，对DNA进行精准的切断

Ⅱ型限制性内切酶的特性：在哪里识别就在那里切割（识别位点及其附近2~6bp），最有工程价值

Ⅰ和Ⅲ型内切酶：切割位点与识别位点分离（Ⅰ型切割较远，Ⅲ型20~50bp）

识别机制：

大沟和小沟

氢键的形成条件

氢键的本质是氢质子和极性原子之间的吸引力，有个矢量方向

量子化学

小沟：构象特异性（无序列特异性）

作用：轻微吸引限制酶，引导松散结合

大沟：序列特异性

作用：强烈吸引限制酶，诱导强烈构象变化

限制性内切酶

原核生物独有，除极少数病毒外，限制酶只在原核生物体内发现，真核生物无限制酶

”限制”一词来源于限制修饰系统，为原核生物独有，用于对抗噬菌体

病毒的偷袭：甲基化、糖基化（糖基转移酶）、靶向蛋白质抑制限制酶

细菌的反制：某些细菌进化出升级版限制修饰系统，可切割已修饰的DNA

酶切位点

合成片段

移码突变：DNA链上插入或缺失的片段非3的倍数（后果非常严重，可致死）

防止移码突变的重要原则：

1、插入或删除的片段长度务必为3的倍数（实际上没有）

2、要修改某个碱基，务必同时选中整组3个碱基（更常用）

翻译过程

标准遗传密码

DNA的方向性

非对称的DNA

腺嘌呤（A）胸腺嘧啶（T）

TAA=（赭zhe石）终止密码子

AAT=天冬氨酸

五环糖：非对称

转录、翻译、限制性内切酶位点识别，方向性皆为从5‘端到3’端

SnapGene软件默认“上链”为“正方向”

多片段的顺序和开放阅读框

原核生物的调控片段

启动子>操纵子（产生遏阻蛋白）>片段A>片段B>片段C>终止子

1、缺一不可

2、顺序不可调换

3、应避免插入其他片段内部

商业化的开放阅读框

不涉及其它关键功能，存在大量酶切位点

质粒（Plasmid）

文件名务必写质粒名

质粒（环形）图标签页（左下角Map）

绿色的限制性酶切位点平末端

黑色的限制性酶切位点黏性末端

序列标签页（左下角Sequence）

菜单栏

3.3 特征标注

打标签是基因编辑的第一步

Ctrl+T（添加特征）：对片段进行命名和注释

片段并不存在方向

另存为，不要覆盖原文件

4.1添加酶切位点：插入片段前的准备

融合以上两个片段即为软件分子克隆的核心原理

三大要点：

位点正确

别接反了（方向性）

三字一组（防止移码突变）

插入酶切位点

复制氨基酸序列，在开头粘贴密码子

左下角的不勾选就没有标注

命名：5‘端酶切位点名-片段名-3’端酶切位点名.dna

注意：不要误以为，酶切位点长度一定是6bp，横跨的氨基酸一定是3个

严守检查规则，准没错

先选两个酶切位点

限制性克隆>插入片段

点击insert

按shift选两个酶切位点就行

点击product合成预览

右下角命名：[片段名]-质粒名.dna

直接保存

插入单一片段：非实用，但必须,无法使用

插入多片段：实用作业

表面展示的价值：

低成本富集

减少纯化损伤

延长酶使用寿命

Police与Thief可以通过脱水方法联系在一起

重点：注意顺序

项目意义：

对于体外酶催化系统而言，采用温和方法提取和保护酶几乎是生命线

作业：

G4Slinker：4个甘氨酸（找密码子）+1个丝氨酸（密码子），就是15个碱基

5.1寻址游戏

模拟PCR和扩增基本没有关系

寻找目标基因片段

绝大多数生物学论文不给序列，只发引物

模拟PCR的例题

primer>add primer

史上最大的蛋白质只有25000个氨基酸

action PCR（CTRL+D）

命名：Amplified-片段名