项目文章 l 5个问题，带你get植物VS病毒的研究思路、方法

2021年11月，山东农业大学园艺科学与工程学院张振鲁团队在Molecular Plant Pathology(IF:5.663)发表了题为“Nitrate-inducible MdBT2 acts as a restriction factor to limit apple necrotic mosaic virus genome replication in Malus domestica”的研究论文，报道了MdBT2蛋白在抑制病毒ApNMV基因组RNA复制中的作用。

文章中所用酵母文库为欧易生物构建。

 研究背景 

先来认识一下苹果和苹果花叶病↓

（苹果谁不认识，你是来搞笑的吗？） 

苹果花叶病中-重度表现（再严重会落叶，降低苹果产量和质量）↓↓↓

且植物病毒病像癌症，无法根除，不过在植株健壮时，不会表现出来。

导致苹果花叶病的病毒，之前一直被认为是苹果花叶病毒（ApMV），近来发现，苹果坏死花叶病毒（ApNMY）与此病更相关，然额，关于该病毒的研究较少，表现为↓

好在，文章中进行了介绍↓

ApNMV与ApMV相似，含有3种正义单链基因组RNAs：RNA1（编码1a蛋白，后面你会经常看到它，对病毒复制至关重要），RNA2（编码RNA聚合酶）和RNA3（编码MP），以及在3种RNA中排名第4的RNA4（编码CP）。

当然苹果如何抵抗ApNMV的研究机制就更少了，背景先讲这么多。

  研究内容  

5个问题，带你get植物VS病毒的研究思路、方法

一、硝酸盐处理对感病植株中ApNMV的RNA复制有啥影响？

实验技术：

1.构建病毒克隆，转化农杆菌后，侵染不同浓度硝酸盐处理过的苹果植株，

2.测定被侵染的苹果叶片中病毒RNA含量（Northern blot，RT-qPCR）。

实验结果：高浓度硝酸盐抑制ApNMY病毒的基因组RNA复制（如图1）。

Fig1 (b) Northern blotting result. (c)RT-qPCR result.

二、硝酸盐处理对感病植株中1a蛋白含量的影响，如何影响？

实验技术：

1.（有啥影响）测定上述样本中病毒1a蛋白含量（western blot）,

2.（如何影响）增加叶片处理方式，查找病毒1a含量变化原因：在硝酸盐处理叶片前，先使用蛋白酶抑制剂MG132和DMSO对叶片进行预处理，同样测定被侵染的苹果叶片中病毒1a蛋白含量（western blot）。

实验结果：硝酸盐处理通过UPS途径使病毒1a蛋白降解（如图2）。

Fig2 Nitrate treatment destabilizes viral protein 1a through the UPS pathways.

三、病毒1a在苹果中遇到了什么?

（即植物抵御病毒的机制研究开始了,

又即为什么用MdBT2作为研究中心和文章标题,

又又即酵母双杂交是用在这儿呀）

实验技术：

1.以病毒1a蛋白为诱饵，筛选苹果酵母cDNA文库（Y2H screen）, 获得了候选互作蛋白MdBT2，

2.体内互作验证（Y2H assay）,

3.对蛋白分段，进行互作的功能域研究（Y2H assay），

4.体外及烟草内互作验证（GST pull down、BiFC、荧光素酶互补验证）。

实验结果：ApNMV 1a与MdBT2互作（如图3）。

Fig3 MdBT2 interacts with ApNMV 1a in vivo and in vitro.

四、MdBT2促进ApNMV 1a的泛素化和降解

（回答文章标题：MdBT2抑制病毒RNA积累原因1）

背景补充：

关于泛素化

（认识一下：泛素本素）

蛋白被泛素化后（即蛋白上结合了泛素），意味着将要被运往蛋白酶体降解，一般用于降解细胞内老弱病残蛋白，再回收利用。同时也被用于排除异己，抵御外敌。该过程需要一系列酶介导：泛素激活酶（E1）、泛素偶联酶（E2）和泛素E3连接酶（E3）。其中E3是起特异性识别作用的，即决定谁该被降解，不能把好同志降解掉。所以E3基因很多，植物中主要有四种类型：HECT、RING、U-box和CRLs。其中CRLs是植物中含量最丰富的E3连接酶。

本研究中，通过酵母双杂交筛选到的标题蛋白MdBT2，整好是CRLs亚家族之一。因此作者推测MdBT2可能在与ApNMV 1a结合后，起到了促进其泛素化和降解的作用。

（互作后，消灭你）

实验技术：

1.构建MdBT2-OE和MdBT2-anti苹果植株（植物突变株构建）,

2.体外检测：使用MdBT2-GFP代替泛素化系统中的E3组分，进行1a-His的泛素化检测（Ubiquitination assays），

3.体内检测：向WT、MdBT2-OE和MdBT2-anti苹果植株中转入pCXSN-1a-HA，MG132处理，测定被泛素化的Ubi（n）-1a-HA含量(IP、IB)，RT-qPCR测定RNA含量。

实验结果：体内外泛素化检测结果显示，MdBT2通过UPS途径促进1a蛋白泛素化和降解(如图4)。

Fig4 MdBT2 inhibits ApNMV genomic RNA replication by promoting the degradation and ubiquitination of viral protein 1a.

五、MdBT2 与2apol无互作，但干扰1a 和 2apol 之间的互作

（回答文章标题：MdBT2抑制病毒RNA积累原因2）

实验技术：

1. MdBT2干扰1a 和 2apol 之间的互作(竞争性pull-down)，

2. MdBT2 与2apol无互作（Y2H assay，GST pull down）。

实验结果：（略），感兴趣同学看原文噢~

 思路总结 

>> 硝酸盐处理后，感病植株病毒RNA含量、蛋白1a（病毒复制相关）含量下降，

>> 以1a为诱饵筛选苹果文库，发现E3家族中的MdBT2与之互作，

>> 通过体内外泛素化实验、发现MdBT2可以泛素化1a，

>> 测定MdBT2过表达及沉默表达的感病植株中1a和RNA含量变化，证实了文章标题。

  研究结论  

硝酸盐处理通过MdBT2介导的泛素-蛋白酶体途径，破坏病毒复制蛋白1a的稳定性，从而抑制ApNMV基因组RNA积累。该研究工作为将以MdBT2作为目标基因，通过遗传育种技术，提高苹果花叶病抗性提供了可能。

  原文链接  

Http://doi.org/10.1111/mpp.13166

 

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海绵宝宝  撰文

本文系欧易生物原创

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