FANCI和FANCD2不同的泛素化功能使ID2-DNA稳定结合

写在前面

        今天推荐的是由英国格拉斯哥大学兽医医学与生命科学学院团队在2020年7月发表于EMBOReports（IF：8.210，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Helen Walden教授，研究表明FANCI和FANCD2的泛素化具有不同的功能，但为了促进和维持ID2-DNA结合而趋同。

研究背景

        Fanconi贫血(FA)是一种罕见的遗传性疾病，由FANC基因突变引起。FANC基因的产物参与DNA支架间交联(ICL)的修复以及维持基因组稳定性以应对复制应激。FA虽然在普通人群中相当罕见，但癌症患者的FA途径基因经常发生改变。

        FA途径是DNA链间交联修复的专用途径，在其他形式的复制应激反应中也会被激活。FA途径中的一个关键步骤是ID2复合物的两个亚基(FANCI和FANCD2)在特定赖氨酸残基上的单泛素化。然而，这些修饰的分子功能在近二十年来一直是未知的。另外，FANCI和FANCD2上泛素的去除对FA途径也是至关重要的，这个去泛素化步骤由USP1-UAF1复合物催化。有证据表明，FANCI和FANCD2参与了其他蛋白质的招募，但其中泛素化作用的机制和结构细节仍然不明。

摘要部分

        作者重建了不同泛素化状态下的人类ID2复合体，并对每个状态的DNA结合进行了表征。研究表明，FANCD2的泛素化显著地增强了ID2复合物与dsDNA的结合。作者发现，FANCD2的泛素化是通过促进复合物中大规模的构象变化来增加ID2对双链DNA的亲和力，由此产生的复合体形成一个次级ID2“臂”的接合面而包围DNA。另一方面，FANCI的泛素化在很大程度上保护了FANCD2上的泛素免受USP1-UAF1去泛素化功能的影响，而FANCI泛素的关键疏水残基对这种保护很重要。总而言之，FANCI和FANCD2的泛素化似乎具有不同的功能，但这两种翻译后修饰都是为了稳定ID2复合物包围DNA的这一构象。

研究内容

1.FANCD2的泛素化增强ID2-dsDNA结合      

        为探究FANCI和FANCD2的泛素化是否影响ID2-DNA结合，作者对人FANCI（IUb）和FANCD2（D2Ub）分别进行泛素化和纯化。然后，作者重组了非泛素化的ID2复合体(I+D2)、ID2Ub复合体以及IUbD2Ub复合体。作者基于PIFE和EMSA两种技术来评估双链DNA与上述复合物的结合。结果发现，与未修饰的ID2相比，FANCD2泛素化的ID2Ub与DNA的结合显著增强。作者还观察到，PIFE实验中的ID2以及ID2Ub与DNA的结合对盐浓度高度敏感，而EMSA测定的相应离解常数受盐浓度变化的影响较小。     
        实验结果显示，与ID2相比，ID2Ub的DNA结合亲和力增强了约10倍，然而相似浓度的D2Ub作用下不能检测到DNA的结合。这表明FANCD2上的泛素本身不足以使DNA结合，但可以增强ID2-DNA的相互作用。有趣的是，与ID2Ub相比，IUbD2Ub与dsDNA的结合亲和力没有明显不同。

研究结论：实验显示ID2Ub和IUbD2Ub与dsDNA的结合能力相近，并且相对于ID2-DNA的结合增强，而D2Ub自身不与DNA结合。这些表明，FANCD2泛素化有助于促进或稳定ID2-DNA结合。

2.FANCD2泛素化与形成二级ID2接合面有关

        为了探究ID2Ub与DNA结合亲和力增强的结构细节，作者以适度的分辨率测定了FANCD2泛素化的重组人ID2复合物的冷冻电镜图谱。图谱结果显示，ID2Ub和IUbD2Ub-dsDNA的总体形状相似，均呈闭合的环状，但与非泛素ID2不同，这暗示FANCD2泛素化后的构象发生了总体变化。进一步的分析表明，FANCD2的C端“臂”发生了主要的移动，并与FANCI的C端“臂”形成新的接合面，从而使ID2复合体处于闭合构像。作者将这个接合面称为“Arm ID2”接合面，该接合面的形成对于ID2-DNA结合构象的形成是必要的。

研究结论：ID2的闭合构象必须稳定才能紧密结合DNA，而FANCD2的泛素化在这一过程起关键作用。

3.Arm ID2接合面是增强ID2-dsDNA结合所必需的

        分析发现，致病性的FANCIR1285Q突变的位点靠近Arm ID2接合面，因此作者假设这种突变可能通过减少ID2的闭合状态而干扰ID2泛素化。作者首先检查了这种突变是否会影响FANCI与DNA以及FANCD2的相互作用，以及是否影响FANCI的泛素化。作者发现，FANCI突变导致ID2复合物中FANCD2泛素化明显减少。另外，最近发现FANCI R1285Q突变不仅导致了ID2复合物中FANCI和FANCD2泛素化减少，而且导致复合物更快的去泛素化。这种较慢的泛素化和较快的去泛素化可能解释了在具有FANCIR1285Q突变的细胞中几乎不存在泛素化的FANCD2/FANCI的原因。

        实验结果显示，当FANCI突变为FANCIR1285Q时，ID2-DNA亲和力没有显著降低，而当FANCD2泛素化时，ID2-DNA亲和力并没有显著增强，这与野生型复合物的情况不同。这些表明，FANCI R1285Q的突变并不直接改变ID2-dsDNA结合，而是限制了FANCD2泛素化和相关的DNA结合增强，这可能是通过中断Arm ID2接合面来实现的。

研究结论：病理性的FANCI R1285Q突变可能是通过干扰ID2的闭合构象破坏ID2泛素化。

4.FANCI泛素化保护ID2Ub复合物免受USP1-UAF1介导的去泛素化

        FANCI泛素化不能进一步增强ID2-DNA的结合，作者假设其主要作用可能是保护FANCD2的泛素不受USP1-UAF1活性的影响。作者比较了USP1-UAF1在一段时间中催化D2Ub、ID2Ub和IUbD2Ub去泛素化的过程。结果发现，在低USP1-UAF1浓度的情况下，D2Ub和ID2Ub以相似的速率去泛素化，然而，IUbD2Ub几乎完全抵抗了USP1-UAF1介导的去泛素化。作者还发现，在较高浓度的USP1-UAF1下，FANCD2可被去泛素化，尽管速度比D2Ub和ID2Ub慢，后者在10分钟内迅速地去泛素化。进一步的分析表明，FANCI的泛素化可使USP1-UAF1对FANCD2的去泛素化减弱。     

        研究结果表明，在ID2Ub和IUbD2Ub的DNA复合物中，FANCD2上的泛素受到保护，从而不受一般DUB活性的影响。这种保护的潜在解释是FANCI可能通过与FANCD2的泛素发生相互作用来阻止DUB接近。FANCI上的泛素在IUbD2Ub-DNA复合物中也不受USP2、USP7和USP1-UAF1去泛素化功能的影响。

        一系列的数据表明，泛素上的F4和I44疏水表面对于IUb介导保护D2Ub的功能非常重要，这可能通过与FANCD2的相互作用完成。事实上，在最近报道的IUbD2Ub-DNA结构中，与FANCI结合的泛素的I44位于FANCD2-泛素的接合面之内，而F4似乎没有直接接触FANCD2。

 研究结论：FANCD2和FANCI的泛素化作用促进形成一个稳定的IUbD2Ub-DNA复合物，此复合物对去泛素化具有抗性。

5.FANCD2和FANCI泛素化的联合作用使ID2与DNA稳定结合

        前面的结果证明了ID2复合物上发生的两个单泛素化事件具有不同功能。作者提出，DNA结合允许ID2达到闭合的ID2构象，在这种构象中形成了Arm ID2接合面。这种构象变化可能暴露了FANCD2的赖氨酸及其邻近的酸性残基，从而允许Ube2T的对接和随后的FANCD2泛素化，从而达到稳定的闭合状态。作者发现，USP1-UAF1在细胞内的作用将使一部分ID2Ub去泛素化从而将ID2恢复到开放状态，但FANCI的连续泛素化可以保护IUbD2Ub不受影响以确保大部分ID2处于封闭状态。因此，FANCD2泛素化似乎通过达到封闭状态来增强ID2-DNA的结合，而FANCI泛素化则通过抑制USP1-UAF1介导的去泛素化来维持这种封闭状态。另外，由于FANCI的K1285位于观察到的ArmID2接合面附近，所以FANCI上的R1285Q突变可以通过抑制闭合的ID2状态和随后的泛素化事件来干扰该接合面行使功能。

        作者的模型提出了一系列事件，首先需要FANCD2泛素化来实现向具有更高DNA亲和力的ID2状态的转变，然后FANCI的泛素化继续维持这种状态。尽管作者不能排除体内存在IUbD2复合物的可能性，但这种复合物更可能是由IUbD2Ub去泛素化产生的。

研究结论：FANCD2泛素化可调节ID2-dsDNA的结合亲和力，而FANCI泛素化则在很大程度上保护泛素化的ID2复合物免受去泛素化的影响。ID2复合体中的两个亚基FANCI和FANCD2分别行使自己特定的功能，从而使该复合体能够在闭合构象下紧紧地结合在DNA上。

结论与讨论

研究表明，ID2复合体的两个亚基FANCI和FANCD2上特定的两个单泛素化具有不同的功能。作者发现FANCD2泛素化可以增强ID2复合物与dsDNA的结合亲和力，而FANCI泛素化则保护复合物免受USP1-UAF1介导的去泛素化作用。FANCI和FANCD2两种功能的联合作用使得在dsDNA上可以形成稳定的ID2复合物。

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原文链接：

https://www.embopress.org/doi/full/10.15252/embr.202050133