组织蛋白质的提取、BCA法测浓度、归一化

1.      注意：冰上处理（切组织可以在干冰上进行）。

2.      30mg心肌组织放至匀浆管。

3.      剪碎。

4.      加入磁珠5-6颗。

5.      加入RIPA+Cocktail （每10ml RIPA里加入一粒Cocktail），每管1000μl。

6.      匀浆机：6500 rpm, 30-40s。

7.      冰上静止30min。

8.      13000rpm 4℃离心10min。

9.      匀浆转移至EP管（用移液枪，尽量吸150μl以上）。

10.   BCA测浓度（96孔板）

        1) 反应液的制备：B液：A液=50:1，每个孔加200μl（总量=（样本数+标准品数）×复孔数×200μl）

        2) 样品与标准品：样品（稀释50倍）：2μl样品+18μl RIPA；标准品（可用8连管，做2个重复）： 50ul标准品 ，20ulPBS，20ulPBS, 20ulPBS, 20ulPBS, 20ulPBS, 20ulPBS, 20ulPBS （8个浓度梯度）

        3) 恒温箱：37℃，30min

        4) 酶标仪：562nm

        5) Excel：A. 标准曲线，得出各样本浓度，乘以10得到蛋白原液的浓度； B.计算Reducing(10x) & Loading Buffer (4x)  & RIPA的体积：先设定最终体系为1ug/ul或者2ug/ul，150ul。

11.   浓度归一化：配制混合液（Reducing, Loading Buffer, RIPA和蛋白原液）。

12.   变性：70℃，15min。

13.   保存：-80℃。

上述文字可结合视频： 

蛋白质提取：https://www.bilibili.com/video/BV1K64y167hk/

BCA法测蛋白浓度： https://www.bilibili.com/video/BV1wq4y1s7gN/

WB 蛋白浓度归一化：https://www.bilibili.com/video/BV1og411j7Ce/