文献解读｜结直肠癌和肝转移之间的免疫表型联系
期刊：Cancer Discover（IF 38.272）
导语
肿瘤微环境(TME)的各种免疫细胞类型影响癌细胞的进展和转移。TME的多个方面，包括密度、位置和功能状态，被认为是与预后和免疫治疗反应性相关的重要因素。快速发展的单细胞RNA测序技术加速了肿瘤内不同细胞群和表型状态的识别，为揭示不同癌症类型之间的TME差异提供了前所未有的机会。例如，CD8+耗竭T细胞（Texs）在肝细胞癌（HCC）和结直肠癌（CRC）中的分数远高于肺癌。此外，在胶质瘤中，驻留巨噬细胞显著，而转移性脑瘤中浸润巨噬细胞更为丰富。因此，越来越多的证据表明不同类型的癌症具有不同的TME，有几个因素可能影响TME，包括体细胞突变、种系变异、表观遗传调节和微生物成分。原则上，不同类型癌症的TME差异可能是由生态位（局部组织微环境）和恶性肿瘤（癌细胞特性）共同引起的，对不同的免疫成分有不同的影响。然而，由于它们对给定肿瘤的TME的影响是交织在一起的，因此很难辨别局部组织微环境或恶性肿瘤的相对贡献。
在这里，本文对51例未经治疗的CRC肝转移（CRLM）和原发性HCC/CRC患者的201个临床样本进行了scRNA-seq分析，并研究了他们的免疫细胞组成和转录动态。本文量化了局部组织微环境和恶性肿瘤对CRLM TME内免疫细胞的影响，并确定树突状细胞（DC）和自然杀伤细胞（NK）的表型与肝脏微环境相关，而T细胞和B细胞以及巨噬细胞表现出较高的异质性。特别是，SPP1+肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）和最近报道的DC人群DC3s被认为是恶性肿瘤驱动的，与CRC患者的不良预后相关。本文的研究证明了TME、癌症类型和宿主器官之间复杂的相互作用，为未来TME如何形成和治疗控制提供了见解。
科学问题
利用单细胞测序探索结直肠癌肝转移（CRLM）的免疫图谱，了解可能塑造TME的内在和外在因素，研究肿瘤微环境在原发位点和转移位点之间的免疫细胞的联系。
研究技术
scRNA-Seq、mIHC（多色荧光免疫组化）
研究思路
研究结果
1. CRLM, HCC, and CRC 样本数据收集及免疫特征
对于CRLM，文章共获取了来自101个匹配样本的CD45+细胞的scRNA-seq数据，这些匹配样本包括原发性结直肠肿瘤（Pri.CT）、邻近结肠（Adj.Col）、肠系膜淋巴结（MLN）、肝转移（Liv.Mets）、邻近肝脏（Adj.Liv）和17例初治患者的外周血。文章分别基于10x Genomics和Smart-seq2获得了323,444和5,004个单细胞的高质量转录组。10X 5'和3'平台都捕获了大多数主要的免疫细胞，包括CD4+和CD8+ T细胞、单核细胞、巨噬细胞、NKT细胞、NK细胞、γo T细胞、DC、肥大细胞、B细胞、3型先天淋巴样细胞（ILC3s）和少量CD45-细胞（图1）。此外，使用Scanpy在每个主要细胞群中进行无监督聚类，共鉴定出78个免疫细胞亚群（图1B和1C）。由于同时分析原发性HCC/CRC和CRLM肿瘤对于解剖癌细胞和器官在形成TME时的相互作用至关重要，文章结合了来自18例初治非转移性CRC患者的49例样本和16例初治非转移性HCC患者的51例样本的scRNAseq数据。为了统一所有数据，本文使用SciBet对CRC和HCC样本的scRNA-seq数据进行了重新聚类，这使本研究能够基于CRLM数据集预测细胞类型。
2. 利用表型比对方法解开癌细胞和宿主器官对TME的影响
在没有CRLM数据的情况下，本文单独对原发性HCC/CRCs的正常和肿瘤数据进行了方差分析，以确定某些免疫细胞群是否倾向于与正常/肿瘤状态或肝脏/结肠位置相关（图2A）。文章发现CD4_Treg-CTLA4，CD8_Tex-LAYN和Mph-C1QC是与宿主组织肿瘤或正常相关的前三个聚类（p< 0.001, ANOVA检验;图2A），在HCC和CRC肿瘤中均表现出高于相应邻近部位的浸润（图2B）。这表明这些细胞可能受到恶性状态的影响。此外，CD8-MKI67、CD4_Treg-IL10和Mph-SPP1也受到肿瘤的影响（p< 0.01, ANOVA检验;图2A）其中，与Adj.Cols和HCC肿瘤相比，Mph-SPP1在CRC肿瘤中富集（图2B）。KLRB1+组织常驻记忆（Trm)）CD8+T和黏膜相关不变T细胞（MAIT）在HCC肿瘤和Adj.Livs中占主导地位，而上皮内淋巴细胞（iel）和Mph-NLRP3在CRC肿瘤和Adj.Cols中表现出更高的丰富度（图2A）。这表明这些细胞可能受到了居住组织的影响。虽然HCC和CRCs之间的直接比较显示恶性肿瘤和器官微环境可能共同形成免疫浸润，但由于癌症类型之间的组间差异，>50%免疫亚群（如Th17和cDC2簇）也明显与恶性肿瘤或器官微环境无关（图2A）。在解释恶性肿瘤的影响时，HCC和CRC癌细胞之间的差异以及患者之间的遗传背景差异也可能使结果复杂化。此外，基于方差分析的分析仅使用频率信息，而忽略单细胞表达谱。因此，本文的目标是通过合并CRLM数据进行进一步分析来解决上述复杂性，因为相同的癌细胞谱系存在于同一患者的不同组织位置。
虽然方差分析可以利用样本的统计学效力来说明免疫浸润水平与恶性肿瘤及器官类型的关系，但由于每例患者作为一个样本处理，样本数较少，无法建立转移部位免疫细胞与原发肿瘤及肿瘤邻近肝组织免疫细胞之间的表型联系。因此，因此本文设计PhenoAligner方法来剖析肝转移免疫细胞与其他组织的表型联系。PhenoAligner的假设是，在不同组织中具有相似转录组表型的细胞可能具有相似的微环境或生态位，因此可能共享外部调节因子以形成相似的表型。
在主要免疫细胞群体水平上，PhenoAligner显示81%的CD45- Cells被归类为原发性结直肠癌相关（图2D），这与CD45人群中癌细胞的主要存在以及这些癌细胞的相同起源相一致。肥大细胞被定性为“恶性肿瘤相关”M型。NKT和NK细胞、DCs 和T 细胞被定义为N型（图2D）。单核细胞和巨噬细胞被定义为C型（图2D）。
3. CD8+耗竭细胞与恶性肿瘤相关且依赖于TCR
尽管CD8+T细胞在结直肠癌肝转移中被分配为N型，根据PhenoAligner分析，他们的子集显示出不同的模式(图3A, 3B)。在所有CD8+ T簇中，两个Tex簇Tex-LAYN和Tex- MKI67被鉴定为N型，因为它们的表型大多与原发性结直肠癌一致（图3A）。这些Tex在两个肿瘤位点也显示富集。Tex-MKI67与Tex-LAYN共享多个T细胞受体（TCR）克隆型和相似的基因表达，也高表达增殖基因，因此，Texs主要受恶性细胞的影响。
为了进一步评估原发性结直肠癌和肝转移部位T细胞是否同源，文章在原发位和转移位中Tex-LAYN细胞群中分别识别到172和149种TCR克隆型，有42种在两个癌点都有存在。表明Tex表现出恶性排他性，并且含有潜在识别肿瘤抗原的TCRs。令人困惑的是，Texs是如何从原发位“迁移”到转移位的。据报道，Texs大都流动性非常低。一种可能的解释是，两个肿瘤部位的Texs起源于相同的前体，并以TCR依赖的方式对相同的癌症相关抗原起反应。
为了进一步探究Texs在原发位和转移位之间的关联，文章进一步检测了Tex和其他T细胞簇之间的TCR共享。结果显示不仅Temras和效应记忆T细胞(Tems)之间存在TCR共享，Tems和Texs之间也存在TCR共享。此外，RNA速率分析显示Temras和Tems之间存在双向流动，而Tems向Texs的分化似乎是不可逆的(图3F)。这些观测结果表明，Tems具有高度塑性和中间性质，可能是M型Texs的前身。即DC呈递抗原给Tn，分化为temra，分别到达原发灶和转移灶的肿瘤位置，进而分化为tem，tem浸润进肿瘤细胞并耗竭，无法再起到t细胞的作用。Tems的这种中间过渡可能是CD8+T细胞肿瘤浸润过程中的重要桥梁步骤，并可能为之前提出的癌症免疫周期提供新的见解(图3G)。
4. 结直肠恶性肿瘤和肝脏生态位对CD4+ T细胞亚群有不同的影响
接下来，本文对CD4+ T细胞进行了类似的分析，观察到T辅助细胞（Th）17、Th1-like 、Treg-IL10和Treg-CTLA4被定性为M型（图4A和4B）。Th17在原发位中富集，IL23R、RORC和ITGAE高表达。Th1样高表达CXCL13和PDCD1。对于三个Treg群体，Treg- foxp3对应血液中的Treg，其他两个对应组织中的Treg。在组织富集的Treg群体中，Treg-IL10高表达肠内Treg标记物，包括IL10、IL23R和IL1R1(图4C)，在结直肠癌癌旁和结直肠癌原发灶中高度丰富，而在肝正常和肝转移中罕见。相比之下，与Treg激活相关的Treg- ctla4高表达基因包括LAYN、CCR8和TIGIT（图4C），与它们的免疫抑制性质一致。此外，与非转移性CRC肿瘤相比，CRLM患者结直肠癌原发灶中Treg-IL10和Treg-CTLA4的比例明显升高（图4D），表明原发性CRC肿瘤伴随肝转移。与非转移性CRC肿瘤相比，可能表现出更强的免疫抑制性，这与小鼠模型得出的结果一致。
从理论上讲，这四种M型簇可以由播种癌细胞塑造，具有两种不同的机制:起源于相同的前体，由癌症相关的抗原触发或被不同来源的癌细胞招募。Treg-CTLA4和Th1-like 中的TCRs在原发位和肝转移之间显示出显著的共享。（图4F）。值得注意的是，在所有CD4+T细胞簇中，只有Treg-CTLA4在原发位和肝转移之间显示出更高的STARTRAC-migr指数。Mets比肿瘤和其他组织之间的指数高（图4H）。此外，两个肿瘤位点的Treg-CTLA4与Treg-FOXP3共享TCR克隆型。此外，RNA速率分析显示了从Treg-FOXP3到Treg-CTLA4的转变方向（图4l），这表明血液中静止的Treg可能迁移到两个肿瘤部位，然后在TME中被激活和扩张。与Th1-like和Treg-CTLA4不同，其余两个簇（Treg-IL10和Th17）的TCRs在原发位和肝转移之间表现出互斥模式（图4G）。因此，这两种机制都存在于CD4+T细胞中。Th17和Treg-IL10被不同来源的肿瘤细胞募集，而Treg-CTLA4和Th1-like来自同一前体。
结论
研究者更进一步探索了cDC2亚群的异质性，发现DC3和cDC2-TIMP1在肿瘤中富集，DC3倾向于富集在结直肠癌原发灶中，而cDC2-TIMP1则更多地出现于肝转移灶中。过往的研究提到DC3在外周血、脾脏和扁桃体中存在，研究者首次在CRLM患者中发现该亚群，DC3和其他三个TAM亚群共同被归类为M-type。C1QC+ TAM具有促炎性和抗肿瘤的特性，而SPP1+ TAM主要存在于转移灶并且具有极高的促血管生成潜能，可以促进CRC肿瘤细胞的转移。该研究为探索不同类型的肿瘤中免疫微环境的特异性和其形成原因提供了范式。
参考文献：
Liu Y, Zhang Q, Xing B, Luo N, Gao R, Yu K, Hu X, Bu Z, Peng J, Ren X, Zhang Z. Immune phenotypic linkage between colorectal cancer and liver metastasis. Cancer Cell. 2022 Apr 11;40(4):424-437.e5. doi: 10.1016/j.ccell.2022.02.013. Epub 2022 Mar 17. PMID: 35303421.
