Native-PAGE 非变性丙烯酰胺凝胶快速制备试剂盒

2. 将配置好的分离胶加到已经固定好的玻璃板间，等待其凝固。

3. 待分离胶凝固后，按照下表中的配方配置浓缩胶，将配置好的浓缩胶加到已经固定好的玻璃板间，并插上梳子，等待其凝固。

将 HA-F 蛋白样品以 3:1 体积比混合非变性 4×Buffer，混合均匀后加入上样

孔中，80 V 电压条件下进行电泳 20 min，之后改为 100 V 条件至电泳结束；

3）凝胶电泳结束之后，使用凝胶染色液染色 25 min，随后使用脱色液脱色 45 min。

待脱色完全之后使用 Tanon-5200 发光成像系统进行图像记录。

2.2.3.3 Western-Blot

HA-G 质粒转染 293T 细胞 48 h 后，于 6 孔板中加入细胞裂解液，离心收集上清，随后进行 6% Native-PAGE。待电泳结束后，将凝胶铺于硝酸纤维素膜上并置于半干式电转仪中，于 15 V 条件下转膜 18 min。用 PBS 清洗载有蛋白的膜3 次后，将膜放入封闭液中，于 4 ℃封闭 12 h 后，PBST 洗涤 3 次，随后加入1:10000 稀释的抗 His 标签鼠单克隆抗体，于室温条件震荡 1.5 h 后，PBST 洗涤3 次，紧接着加入 HRP 标记的鼠二抗稀释液，于室温条件震荡 45 min 后，PBST洗涤 3 次，最后进行 ECL 显色。

WB结果好看的几点经验

1、60V 3h；

2、HIS一抗特异性；

3、孵育一抗4°过夜，和封闭可以一起；

4、一抗清洗需要多次，时间尽量久点；

5、孵育二抗后，清洗尽量多次，时间久点；