CRISPR/Cas9系统编辑效率验证常用方法盘点
前面几期内容小编就CRISPR/Cas9介导的基因敲除实验流程及sgRNA的设计进行了整理分享。基因敲除实验一般要经过以下几个过程：确定敲除目标基因及细胞→根据目标基因设计sgRNA序列→构建sgRNA及Cas9表达载体（质粒、病毒等）→转染细胞→筛选阳性混合克隆→挑选并培养单克隆→检测编辑效率，鉴定敲除类型→成功建立KO细胞系。本期内容，小编整理了几种CRISPR/Cas9系统编辑效率验证的常用方法，供小伙伴们参考。
一、SSA活性检测，适用于初步检测sgRNA活性，排除无活性sgRNA。
图1.基于同源定向修复（HDR）/单链退火（SSA）的sgRNA活性检测荧光报告系统
（图片来源：Yang Y at, 2016）
单链复性(Single-strand annealing，SSA)检测，可以验证打靶质粒是否具有切割裸露DNA的能力，是初步评估CRISPR-Cas9系统有活性的常用方法。与基于HDR的活性验证相比具有更高的灵敏性和准确度。将荧光蛋白编码序列分为前后两段，前一段的最后200bp与后一段的前面200bp为同源序列，将两端序列分别克隆至SSA报告质粒中，在两者中间插入含有一个终止密码子和一段sgRNA的靶序列。当常规质粒sgRNA特异性检测载体单独转染到细胞中时，不会观察到绿色荧光。然而，如果将该载体与Cas9和相应的sgRNA载体一起共转染到细胞中，则sgRNA-Cas9复合物将被募集到两段荧光蛋白编码序列之间的sgRNA靶序列上，从而切割使双链DNA断裂，随后荧光蛋白前段序列与后段序列的同源区域发生同源重组。同源重组后将产生完整的功能性荧光蛋白编码序列，继而表达绿色荧光蛋白。通过分析荧光细胞的比例，比较不同sgRNA靶位点被CRISPR/Cas9编辑的效率。另外，在该系统中，可以在荧光蛋白前后两端序列之间串联克隆多个sgRNA靶位点（每个都应包含PAM序列），通过与Cas9和相应的sgRNA共转染分别测试。此方法的缺陷在于要同时向工具细胞转染Cas9/sgRNA以及报告质粒，转染效率对最终的编辑效率分析会产生较大的影响。另外正式实验中目标位点可能受到染色质结构和表观遗传状态的影响，所以此方法评估的结果仅可作为排除无活性sgRNA的依据，而非筛选活性sgRNA。
二、错配酶切法鉴定编辑效率。适用于混合克隆或单克隆打靶验证，简单直观但无法判断具体突变类型及序列。
错配酶切法可以有效的切割鉴定DNA中存在的不配对的碱基。提取对照组和实验组细胞基因组，并且在编辑位点前后设计引物进行PCR，再将对照组和实验组的PCR产物混合退火。野生型和突变型PCR产物杂交，就会产生存在不配对的碱基。核酸错配酶就会识别切割DNA中不匹配的碱基位点，并在错配处切割PCR产物，根据最后的琼脂糖凝胶电泳结果分析DNA的切割率。目前错配酶法鉴定基因编辑效率应用较多的是T7E1，T7E1不仅可以切割DNA中双链中不匹配的碱基，也可以切割十字形DNA结构、DNA分叉点以及异源二聚体DNA等，因此会存在假阳性率。此外还有CEL1酶也可进行碱基的错配鉴定。
图2. T7E1酶检测切割情况流程示意图
具体实验细节：
1、 引物设计： 上下游引物距离切割位点长度不要一样长，保证T7E1错配酶切割过的DNA序列呈现出有长有短，这样琼脂糖电泳后呈现的就是上下不同的条带，且保证靶点距上下游引物均在100bp以上。
2、 制备待检测DNA片段：一般利用设计的特异性引物进行PCR扩增，获得待测混合克隆DNA片段。如果待测样品本身是单克隆样品，则还需通过PCR获取野生型样品DNA片段。
3、 混合克隆DNA片段或待检单克隆DNA片段与野生型样品DNA片段等量混合，另以野生型DNA作为阴性对照。按照以下步骤进行退火反应：待测DNA样品1-3ug+缓冲液3ul+ddH2O将总反应体积补充至30ul。反应条件：98℃反应10min，缓慢降温至室温。
4、 将经退火处理的DNA样品20ul与T7E1核酸错配酶0.5ul混匀，37℃酶切30min；
5、 电泳分析一般使用1.8%浓度的琼脂糖凝胶电泳分析产物，若片段较短，建议使用0.5×TBE buffer效果更佳。
注意：不同试剂盒反应条件及时间有所调整，请根据具体试剂盒指南进行以上操作。
三、sanger测序，最精确，可直观展示编辑后的DNA序列。
在成功获得混合克隆或单克隆细胞后提取基因组DNA进行sanger测序，可判断敲除效果或敲除类型：
1、 混合克隆：测序图谱在PAM附近出现套峰，混合克隆中有成功敲除的单克隆。
2、 单克隆细胞株：对照野生型细胞基因测序结果确定所挑单克隆细胞的突变类型及具体突变序列。单克隆敲除细胞株sanger测序可能出现的几种情况：
图3：不同情况测序结果示意图
四、WB检测，适用于获取不同的敲除单克隆细胞株后的检测，鉴定目标基因功能是否被完全敲除最彻底的方法。提取部分单克隆细胞株蛋白，利用特异性抗体进行WB检测目的蛋白是否表达，通过结果分析敲除效果。若抗体特异性好（条带单一）还可以简化为Dot blot，同时快速检测多个单克隆细胞株的敲除情况。
图4. Dot blot结果示意图
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参考文献：
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