「青莲客户文章」EIF2AK2作为小檗碱抗炎作用的直接关键靶点
继证明NEK7是小檗碱（berberine，BBR）治疗炎症相关疾病的主要直接靶点后，中国医学科学院&北京协和医学院药物研究所宋丹青导师和汪燕翔导师团队又发现并证明了EIF2AK2也可作为BBR抗炎作用的直接关键靶点，相关研究成果发表在APSB（Discovery and identification of EIF2AK2 as a direct key target of berberine for anti-inflammatory effects ；IF 14.903；2022年12月）上，和小编一起共享这一成果吧！
01 研究背景
小檗碱（berberine，BBR）可从黄连、黄柏、血红小檗等植物的根茎中通过分离提取出来天然生物碱，在过去的20年中，它被作为中国天然抗疟药物广泛应用。虽有较多包括RXRα、NEK7、MKK7等在内的作用靶点已被鉴定和证明，但是BBR复杂而巧妙的网络机制尚未完全阐明。文章选用活性蛋白组分析技术（ABPP），使用BBR亲和探针寻找对抗炎症的关键直接靶点；通过体外结合试验和正交验证实验，表明EIF2AK3是BBR抗炎作用的关键靶点。
02 样本策略
LPS和Nigericin诱导PMA-THP-1细胞；EIF2AK2 siRNA诱导HEK-293细胞、HMCC3细胞、Hepg2细胞；EIF2AK2基因敲低小鼠
03 技术策略
LC-MS/MS鉴定（青莲百奥提供）
04 结果速递
1.THP-1细胞中BBR靶点的荧光标记
文章用LPS和Nigericin诱导PMA-THP-1细胞建立炎症细胞模型，用Elisa分析培养基上清中分泌的炎症因子，结果表明probes-7a和probes-11b表现出较好的抑制IL-1β的作用；用ABPP法测定和识别两探针的靶向作用，结合SDS-PAGE评估并筛选合成的BBR光亲和荧光探针，结果表明probes-11b在一定的浓度范围内呈现出更显著的荧光强度。
2.BBR靶标蛋白分析
文章用probes-11b与PMA-THP-1细胞进行孵育，加入或不加入BBR（100μmol/L）预处理；通过LC-MS/MS分析鉴定被标记的蛋白。基因本体（GO）富集表明，44种蛋白密切参与各种炎症信号通路，其中13种是通过蛋白相互作用分析的炎症相关蛋白。通过分析这些蛋白的综合功能和参与途径，包括EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3、DDX3X、VASP和VPS4B在内的六种蛋白可以调节两种或多种炎症途径，并有可能在BBR的抗炎效力中发挥关键作用。
3.BBR与其潜在靶标之间的亲和力研究
在HEK-293细胞中进行CETSA实验，以验证BBR与四种靶蛋白之间的相互作用。在35至75℃的温度范围内，添加BBR（10μmol/L），EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B的热稳定性得到不同程度的增强（图3A），表明BBR与这四种蛋白质之间可能存在直接相互作用。随后，使用重组蛋白进行SPR分析以进一步确认，具有EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B的BBR的Kd值分别为7.12、13.4、23.7和16.8μmol/L（图3B–E）。此外，使用Discovery Studio 4.5软件进行了BBR与四种蛋白质之间的分子对接，对接得分分别为100.2、88.8、86.7和91.6，与亲和力值基本一致（图3F）。这些结果再次验证了BBR与这四种靶蛋白之间的特异性相互作用，其中BBR与EIF2AK2具有最强的亲和力。
4.体内外功能验证EIF2AK2是BBR作用靶标
为了进一步了解EIF2AK2的功能作用，选用PMA-THP-1细胞中IL-1β的释放来验证NLRP3炎症小体的功能。BBR抑制NLRP3的表达从而阻断下游IL-1β的释放，而EIF2AK2受到其抑制剂C16的药理学抑制，未观察到NLRP3表达和IL-1β释放的减少（图4D和E），这推断BBR可能通过作用于EIF2AK1来抑制NLRP2的表达和IL-1β的释放。
由于EIF2AK2在脑组织中相对高表达，文章验证了EIF2AK2与人源性小胶质细胞（HMC3）中炎症通路的相关性。发现BBR可以下调LPS诱导的p-NF-κB p65和pJNK（图4F和G），而下调EIF2AK2后，BBR对p-NF-κB p65和p-JNK的抑制作用部分或完全消失。这说明，BBR可以通过靶向EIF2AK2影响大脑炎症反应，并提供了BBR如何在大脑中产生抗炎相关疾病的可能机制，如阿尔茨海默病中的胶质细胞增生和认知障碍。
另外，BBR可以抑制棕榈酸（PA）诱导的p-JNK水平，并上调HepG2细胞中SIRT1蛋白的表达。结果进一步表明，BBR可能通过与关键蛋白EIF2AK2结合来调节炎症诱导的脂质代谢紊乱(图4H)。
构建了EIF2AK1敲除小鼠模型，结果发现BBR可能通过靶向EIF2AK2下调IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α分泌（图5B–F）。肝脏的HE染色结果也同样发现，在EIF2AK2基因敲除小鼠中，BBR减轻了肝脏组织的炎症浸润，而在其他组织中未发现明显损伤。
05 总结
利用化学蛋白质组学技术，我们首次将EIF2AK2、eEF1A1、PRDX3和VPS4B鉴定为小檗碱（BBR）协同抗炎作用的直接靶点。其中，BBR通过两个离子键与EIF2AK2具有最强的亲和力；此外，BBR可以微妙地抑制EIF2AK4的二聚化，以选择性地调节其下游途径，包括JNK、NF-κB、AKT和NLRP3，具有良好的安全特性的优点。该结果突出了BBR在抗炎作用中的网络机制，其中EIF2AK2是关键靶点，抑制EIF2AK1二聚化有可能成为对抗炎症相关疾病的治疗跨界。
