「青莲客户文章」揭秘柑橘多甲氧基黄酮合成的神秘酶：CsCCoAOMT1的关键作用

标题：A multifunctional true caffeoyl coenzyme A O-methyltransferase enzyme participates in the biosynthesis of polymethoxylated flavones in citrus.

期刊：Plant Physiology Oncogene（IF =8.756）

时间：2023.03

背景

柑橘类植物是一类重要的经济作物，富含多种生物活性化合物，其中多甲氧基黄酮是其特有的类黄酮成分之一。多甲氧基黄酮(PMFs)在植物中具有抗氧化、抗炎、抗癌等多种生物活性。大量的研究报道也表明PMFs在治疗糖尿病、心血管疾病、结肠癌、肥胖症、痴呆症等方面发挥着重要作用，对人类健康具有重要意义。然而，关于PMFs在柑橘类植物中的合成机制及其参与的酶仍存在许多不明确的地方。

研究思路

柑橘果皮特异性地积累丰富的PMFs，甲基化修饰是PMFs生物合成的关键步骤；然而，报道的柑橘O-甲基转移酶（OMT）的功能不足以阐明PMFs的完整甲基化过程。作者以橙子品种“冰糖橙”为试材，研究了不同发育时期果皮中PMFs的积累规律。为揭示多PMFs的生物合成途径和相关酶的功能，研究选择了一个名为CsCCoAOMT1的酶进行深入研究。通过对CsCCoAOMT1的功能研究，可以更好地理解多甲氧基黄酮的合成机制以及柑橘类植物中相关代谢途径的调控机制。

研究内容

1、橙子PMFs积累规律研究

PMFs是一类重要的类黄酮，其骨架中的所有羟基都会被甲基化，并且在不同柑橘品种和组织中的含量显示出实质性差异。在对62个柑橘品种的黄酮类化合物代谢分析中，发现柑橘的PMFs含量最高，其次是橙子，而柠檬和葡萄柚的PMFs含量则相对较低。PMFs在橙子果实的外果皮中含量丰富，在其他组织中未检测到。为进一步阐明冰糖橙果实中PMFs的积累规律，作者对不同发育时期（S1 ~ S9）果皮中PMFs的含量进行了分析，共检测到6种PMFs，即异橙黄酮（Isosinensetin）, 甲基化黄酮（Sinensetin），川陈皮素（Nobiletin），木犀草素四甲醚(5,7,3',4'-Tetramethoxyflavone )，甲氧基黄酮（Heptamethoxyflavone），桔皮素（Tangeretin）。其中，甲基化黄酮（Sinensetin）是“冰糖橙”中积累的主要PMF，平均值占PMFs总量的57%，其次是川陈皮素（Nobiletin），占PMFs总量的24%。除Heptamethoxyflavone外，所有PMFs在S1 ~ S9期间均呈现出一致的变化趋势，在S2达到最高值，S2-S4下降;在S5阶段出现一个小峰值，然后下降到S6阶段，PMFs含量在S6-S9阶段趋于稳定。表明PMFs的积累可能是在果实发育早期完成的，S6及以后各时期PMFs含量的急剧下降可能与S6时期果实的快速膨大有关。

2、CsCCoAOMT 1是一种多功能的O-甲基转移酶

在柑橘类黄酮OMTs的鉴定方面包括功能预测、基因克隆和功能鉴定，许多研究都集中在COMT亚家族，作者最终鉴定出3个参与类黄酮体外甲基化的COMTs（分别对应于CsOMTs中的Cs2g05400、Cs5g16290和orange1.1t04194）。在分析CCoAOMT亚家族7个成员在“冰糖橙”果实外果皮不同发育阶段的转录水平后发现两个CCoAOMT基因（Cs1g22450和Cs8g05410）在早期发育阶段表现出明显的高表达，这与PMFs在该时期的快速积累相一致。因此，这两个基因被认为是参与PMFs生物合成的候选基因。其中一个候选基因（Cs 1g 22450）已被证明参与柑橘中的PMF生物合成（Liu et al. 2020b）。因此选择另一个候选基因（Cs 8 g 05410，命名为CsCCoAOMT 1）进行后续深入研究。为了进一步阐明CsCCoAOMT1的系统发育关系，作者选取了34个不同植物种类的CCoAOMT，构建了系统发育树。鉴定出一个CCoAOMT亚群成员（Cs8g05410）名为CsCCoAOMT1。从“冰糖橙”外果皮cDNA文库中克隆了CsCCoAOMT 1基因的全长。CsCCoAOMT 1编码的蛋白质通过His标签进行重组蛋白表达。通过质谱法检测CsCCoAOMT1蛋白的表达水平（青莲百奥提供技术服务）。通过酶活性分析和代谢物检测来揭示CCoAOMT的催化特性和参与的代谢途径。他们发现CCoAOMT不仅可以催化咖啡酰辅酶A的O-甲基化反应，还具备O-甲基转移其他底物的能力，表明该酶具有多功能性。

3、CsCCoAOMT1促进柑橘多个PMFs的积累

作者在柑橘中鉴定了CCoAOMT，并证实了其在体外对PMFs的潜在前体的偏好。CsCCoAOMT1与Ciclev10029158m序列同源性为98%，甲基化位点较CrOMT1更宽，且在发育过程中在果皮中PMFs积累前表现出较高水平，说明CsCCoAOMT1参与了黄酮类化合物甲基化。CsCCoAOMT1在果实发育早期（S1）表现出较高的转录水平，这表明该基因可能是在随后20 d内PMFs持续增加的原因。CsCCoAOMTl在S6至S7处的高表达可能与果皮发育后期增强的木质素积累相关，其对应于CsCCoAOMT 1在体外对木质素前体咖啡酰辅酶A的催化活性。CsCCoAOMT 1在“冰糖橙”果皮中瞬时过表达后，6种PMFs的含量均显著上调，其中川陈皮素（Nobiletin）和甲氧基黄酮（Heptamethoxyflavone）的含量变化极显著（P < 0.01）。这两个PMFs都有至少4个O-甲基化位点，与CsCCoAOMT 1在体外的甲基化位点完全一致。同时，CsCCoAOMT 1基因在橙子幼苗中被沉默，而5种主要的PMFs（sinensetin、nobiletin、5，6，7，4 ′-tetramethoxyflavone、tangeretin和5-HPMF）在阳性植株中也表现出极显著的下调，而橙皮苷含量没有观察到显著的变化。这些结果揭示CsCCoAOMT 1表达与柑橘PMFs积累之间的正相关性，并支持CsCCoAOMT 1可以促进柑橘中多种PMFs的积累。

总结

作者描述了柑橘果皮中PMFs含量的动态变化，并捕捉到了PMFs生物合成的关键时期。对柑橘中一种CCoAOMT酶CsCCoAOMT1进行了表征，发现它在体外表现出对槲皮素和黄酮类底物的强烈偏好性，在邻位羟基环境下甲基化6、7、8和3′位羟基，是PMFs生物合成的重要位点。此外，CsCCoAOMT1作为一个多功能酶，显示低催化活性的咖啡酰辅酶A和七叶素。体内瞬时过表达和VIGS实验验证了CsCCoAOMT1在促进柑橘中多种PMFs的生物合成中具有重要作用。这些发现对于改善柑橘果实的营养品质以及利用酶工程合成天然生物活性物质具有重要意义。