项目文章丨眼附属器 B 细胞淋巴瘤的蛋白质转录组学揭示了选择性剪接的致癌作用并确定

2022年7月，上海交通大学医学院附属第九人民医院范先群课题组在 Journal of Experimental & Clinical Cancer Research 发表了题名为“Proteotranscriptomics of ocular adnexal B-cell lymphoma reveals an oncogenic role of alternative splicing and identifies a diagnostic marker”的研究论文，该研究利用转录组学和蛋白组学以及其它技术手段提供了一个综合的基因表达谱，并证明了高全局蛋白质-mRNA一致性是眼附属器 B 细胞淋巴瘤（OABL）的预后相关分子特征，此外，作者还描绘了 OABL 的选择性剪接事件景观，并揭示了 ADAR 的致癌作用。该研究中的转录组测序和 TMT 蛋白组服务由博奥晶典提供。

【发表期刊】Journal of Experimental & Clinical Cancer Research

【发布时间】2022年7月

【影响因子】12.658

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研究路线

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研究背景

淋巴瘤是起源于淋巴造血系统的恶性肿瘤。根据瘤细胞分为非霍奇金淋巴瘤（NHLs）和霍奇金淋巴瘤（HLs）两类。眼附属器淋巴瘤 (OAL) 是一种罕见的恶性淋巴增生，占 NHLs 的 1-2%。OALs 常出现在结膜、眼睑和眼眶，还有泪腺等部位。大多数 OALs 是 B 细胞淋巴瘤。结外边缘区 B 细胞淋巴瘤 (EMZL) 是 OABL 最常见的亚型 (55–69%)，其次是弥漫性大 B 细胞淋巴瘤 (DLBCL) (10–15%)。近年来，虽然 NHLs 的研究已经实现了突破性进展，但对 OABL 的研究很少。

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研究结果

1. OABL 的综合蛋白转录组学图谱

作者按照研究路线中的流程来进行 OABL 的研究。通过对转录组和蛋白质组数据中的高可变基因 (HVGs) 和样本进行层次聚类，发现大多数 OABLs 和对照分为两组。在去除低丰度转录物/蛋白质后，将转录物和蛋白质映射到 Ensembl ID，并在这些样本中检测到 3639 个蛋白质-mRNA 对。对于这些蛋白质-mRNA 对，计算了 OABLs 和对照之间的差异表达基因（DEGs）（图 1B）。结果表明，与对照相比，OABLs 蛋白质组中有 787 个基因上调，542 个基因下调；OABLs 转录组中 806 个基因上调，445 个基因下调。通过组学数据匹配结果，发现 451 个基因一致上调（CO-UP），386 个基因一致下调（CO-DOWN )。CO-UP DEGs 主要富集于免疫相关、GTPase 信号、磷酸盐代谢过程的负调控和 DNA 重组等 GO 条目。CO-DOWN DEGs 主要富集于正常组织发育、一元羧酸、精氨酸和脯氨酸代谢等 GO 条目（图1C）。

为了避免研究的潜在系统偏差，作者进一步进行 GSEA 分析以识别 OABLs 中重叠的失调基因集。通过蛋白质组学和转录组学数据鉴定出总共 1023 个基因集。其中，763 个基因集在至少一种类型的组学中显著失调，725 个基因集一致失调（图1D）。根据每个组学中 NES 等级的总和排列，CO-UP 基因集主要富集于 mRNA 加工和剪接、DNA 损伤和修复以及蛋白质苏木化等条目。CO-DOWN 基因集主要富集于正常组织发育，以及有氧葡萄糖代谢等条目（图1E）。

图1 OABL 的蛋白转录组学特征
2、全局蛋白质-mRNA 一致性是 OABL 的远处复发相关特征接下来，作者检查了蛋白质和 mRNA 丰度之间的关系及其与疾病特征的关联。全局蛋白质-mRNA 一致性计算为每位患者所有配对蛋白质和 mRNA 丰度的 Spearman 相关结果（图2A）。考虑到 OABLs 和对照之间不同的转录本/蛋白质丰度分布，分别分析了这两组中的蛋白质-mRNA 对。在 OABLs中鉴定出 3818 对蛋白质-mRNA 对，在对照中鉴定出 3728 对。OABLs 的一致性显著高于对照组（图2B-C）。考虑到炎症和淋巴瘤之间的关联，比较了亚组样本的全局一致性。结果表明，OABLs 表现出比其他组更高的一致性。这些数据表明，蛋白质和 mRNA 丰度之间的相关性增加是 OABLs 的疾病相关特征。作者接下来分析了蛋白质-mRNA 一致性是否与疾病侵袭性有关。比较了亚型、Ann Arbor 分期和预后风险因素之间的一致性（图2D）。结果显示，无 EMZL 亚型的一致性显著高于 EMZL 亚型，高一致性与较高的 LDH 和 IPI 两个 NHLs 预后危险因素显著相关，另外，高一致性还与较高的 Ann Arbor 阶段相关。接下来，测试了蛋白质-mRNA 一致性与 OABL 预后之间的相关性。作者使用一致性的中值将 OABL 患者分为两组，生存分析显示，OABL 的全局一致性增加与 DRFS 降低显著相关。然后，比较了有和没有复发事件的患者之间的全局一致性（图2F）。高一致性与远处复发事件显著相关，但与局部复发事件无关。随后，作者继续研究了异常上调的全局蛋白质-mRNA 一致性的潜在调节剂和生物学意义。因为全局一致性是一个内在的连续变量，作者检查了 GSVA 结果与一致性之间的相关性（图 2H）。在前 20 个正相关基因集中，有 8 个基因集是 TP53 相关基因集，其余大部分是免疫相关基因集。这些发现表明，增加的整体蛋白-mRNA 一致性是 OABLs 的一个新分子特征，与疾病侵袭性和更高的复发风险相关，OABL 中这种异常上调的一致性与 TP53 通路呈正相关。

图2 全局蛋白质-mRNA 一致性识别为 OABL 相关特征

3、趋势分析将选择性剪接确定为 OABL 的炎症独立特征在蛋白质转录组学数据中，作者通过层次聚类、主成分分析和全局蛋白质-mRNA 一致性观察到炎症和 OABL 样本之间分子特征的相似性（图2C，图3A-B）。先前研究表明，NFκB 信号通路在炎症和 NHLs 中激活，作者在跨亚组的 NFκB 信号通路中进行了层次聚类（图3C），NFκB 相关基因的丰度逐渐增加，从正常到炎症再到 OABLs，这与之前的报道一致。随后，作者通过对正常、炎症和 OABL 组的监督和非监督聚类基因在蛋白质组数据中构建了一个炎症-OABL 特征。作者对每两组之间的蛋白质丰度进行了 t 检验，并假设了九种失调的基因模式（图 3F），结果发现，大多数由上调模式构成。结合 k-means 聚类和 t 检验基因模式的结果，作者确定了五个基因簇：炎症模拟上调基因（MIMIC-UP）、模糊上调基因（VAGUE-UP）、OABL 特异性上调基因（SPECIFIC-UP） ，炎症模拟下调基因（MIMIC-DOWN）和 OABL 特异性下调基因（SPECIFIC-DOWN）（图3G）。因为上调的基因构成了大多数聚集蛋白，作者专注于 MIMIC-UP 和 SPECIFIC-UP，它们代表了极其不同的失调模式。MIMIC-UP 主要富含免疫相关基因集，而 SPECIFIC-UP 主要富含与 mRNA 代谢和剪接、DNA 损伤和代谢以及染色质重塑相关的基因集（图 3H）。这些结果清楚地表明，炎症组和 OABLs 组之间的相似性不仅存在于 NFκB 途径中，还存在于更大的免疫环境中。另外，作者确定了 OABL 中特异性失调的基因集，包括 mRNA 剪接和与恶性肿瘤发展相关的途径（DNA 损伤、染色质重塑）。

图3 炎症-ABL 蛋白特征的建立

4、选择性剪接及其调节器可能影响 OABL 的发展和进展

选择性剪接在 OABL 中起着重要作用。研究结果揭示了 OABLs 中炎症独立模式中的可变剪接失调（图1E，3H）。据报道，选择性剪接与恶性肿瘤的发展和进展有关。因此，作者假设可变剪接可能在 OABL 中发挥致癌作用。

接下来，作者构建了一个工作流程来 1）评估原始 RNA 测序数据并与对照相比识别 OABL 的异常选择性剪接事件（AASE）；2) 联合临床数据以识别与预后相关的 AASE；3）结合蛋白质组学数据研究潜在的剪接调节因子和 AASE 的生物学功能（图4A）。分析了五种类型的选择性剪接事件（ASE）：替代 3' 剪接位点 (A3)、替代 5' 剪接位点 (A5)、互斥外显子 (MX)、保留内含子 (RI) 和跳跃外显子 (SE)，共鉴定出 1806 个 AASEs。这些 AASEs 总共影响了 916 个基因，其中大多数受 SE 影响（图4C）。在 916 个 AASEs 相关基因中，651 个基因仅受一种 ASE 的调节，而其余基因则受多种 ASEs 的影响（图4B）。

随后，研究了 AASE 的生物学意义。AASE 相关基因富集在细胞骨架、Rho GTPase 和细胞器相关条目（图4D）。然后，通过将 AASE Inclevel 与蛋白质组数据的 GSVA 结果相关联来分析潜在的牵连生物学功能（图4E）。在列出的前 20个 基因集中，有 8 个与 DNA 损伤和细胞周期有关。这些数据共同表明 AASE 广泛存在于 OABL 中并与预后相关，表现出选择性剪接的基因与 OABL 中失调的基因集有关。AASE 与关键的生物学功能相关，如 DNA 损伤和细胞周期，这可能意味着它们充当这些过程的转录后调节剂。

图4 OABL 异常选择性剪接事件
5、ADAR 是 OABL 中选择性剪接的核心调节因子，影响关键生物学功能ADAR 是作用于 RNA 酶家族的腺苷脱氨酶的成员，可催化双链 RNA 中的腺苷编辑为肌苷。在相关性分析中，作者发现 ADAR 是与 AASE 和进展相关 AASE 相联系的高频剪接因子（SF）（图 4F，H）。作者接下来研究了与 ADAR 相关的潜在生物学功能，发现 ADAR 的蛋白质丰度与影响 145 个基因的 280 个 AASEs 密切相关。这些基因大多富含 Rho GTPase 相关基因集（图5A），这是肿瘤起始和进展中细胞内信号传导的重要基因集和关键转导。为了进一步检查 ADAR 的作用，作者在 11 组 ADAR 敲低 (KD)、敲除或过表达癌细胞系中鉴定了 AASE。共有 1472 个基因反复受到 ADAR 调节的 AASE 的影响。这些基因也富含 Rho GTPase 相关基因集（图5B）。因为受影响的基因富含凋亡和增殖相关基因集（图5A，B），作者研究了 ADAR 和 MKI67 之间的关系，结果发现，ADAR 蛋白丰度与 MKI67 呈正相关（图5C）。为了验证假设的调节作用，作者建立了 ADAR KD NHL 细胞系。与对照细胞相比，ADAR KD 细胞系表现出显著降低的细胞增殖（图5E）。进一步发现 ADAR KD 使 NHL 细胞系对 Rho GTPase 抑制剂敏感。Rho GTPase 抑制剂在处理 72 小时后的 IC50 在 ADAR KD 细胞系中低于对照（图5F）。这些结果表明，ADAR 是 OABL 中可变剪接的核心调节因子，可调节细胞增殖和对 Rho GTPase 抑制剂的敏感性。

图5 ADAR 调节 OABL 中的关键生物学功能
6、蛋白质组学分析将 DNAJC9 鉴定为 EMZL 的诊断标志物OABL 的病理诊断仍然很困难。因此，作者检查了蛋白质组学数据以研究 OABL 的潜在诊断标志物。生物标志物检测的工作流程如图6A 所示。为了筛选生物标志物，首先通过单变量逻辑回归确定了 98 种差异表达的蛋白质和 98 种重要的蛋白质。接下来，将 85 个重叠的蛋白质纳入 lasso 惩罚回归模型，通过 200 次交叉验证迭代分析得到 4 种蛋白质（DNAJC9、TFEB、SUMO3 和 MBD1）。然后对这些蛋白质进行逐步逻辑回归，DNAJC9 是唯一确定的蛋白质。为了验证结果，分析了各组 DNAJC9 的蛋白质丰度（图6B）。与对照组、IOI 和 RLH 组相比，OABLs 中的 DNAJC9 丰度显著更高。与对照相比，OABL 所有亚型的 DNAJC9 丰度也显著升高。与传统的诊断标志物 CD20 和 PAX5 相比，DNAJC9 表现出相对较高的 AUC 值（图 6C）。接下来，作者研究了 DNAJC9 在患者 FFPE 样本中的诊断性能。选择 EMZL 和 DLBCL（OABL 的两个主要亚型）作为实验组，炎症样本作为对照。亚细胞定位分析表明，DNAJC9 定位于 OABLs 的细胞核和炎症组织的淋巴区域。在 OABL 的癌旁部位和炎症的腺体区域中，DNAJC9 定位于细胞质中。大多数 DNAJC9 在淋巴区域和 OABL 的同一细胞中与 CD20 共表达（图 6D-E）。与对照组相比，EMZLs 和 DLBCLs 中 DNAJC9 的 MFI 显著升高。与炎症相比，OABLs 中 CD20 的 MFI 并不高（图 6E）。IHC 分析显示，与炎症相比，EMZL 中大块细胞和细胞核的 DNAJC9 染色评分均显著高于对照（图 6F-G）。对于 DLBCLs，大块细胞的染色评分与对照相比没有显著提高，而与 EMZLs 相比，细胞核的染色评分显著降低。这些结果表明，DNAJC9，尤其是 DNAJC9 的强核染色，是一种潜在的 EMZL 病理诊断标志物，可以区分 EMZL 和炎症。

图6 蛋白质组学分析将 DNAJC9 鉴定为 OABL 的诊断标志物

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研究结论

该研究提供了一个综合的基因表达谱，并证明了高全局蛋白质-mRNA 一致性是 OABL 的预后相关分子特征。作者描绘了 OABL 的选择性剪接事件景观，并揭示了 ADAR 的致癌作用，另外，还将 DNAJC9 的强核染色鉴定为结外边缘区淋巴瘤的有希望的病理学诊断生物标志物。

参考文献：

Shi J, Zhu T, Lin H, Liu Z, Zhou M, Yu Z, Zhou X, Song X, Wang Y, Jia R, Fan X, Zhou Y. Proteotranscriptomics of ocular adnexal B-cell lymphoma reveals an oncogenic role of alternative splicing and identifies a diagnostic marker. J Exp Clin Cancer Res. 2022 Jul 30;41(1):234.

博奥晶典科研服务事业部 刘瑞明丨文案

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