项目文章 | 高效化学同位素标记（HP-CIL）代谢组学技术探索唾液样本中阿尔茨海默病的
一、背景介绍
阿尔茨海默病(AD)是一种影响认知能力和行为表现的神经退行性疾病，目前面临早期确认信号缺乏以及预后的精确度差等问题。相比于脑脊液、血液等，唾液具有无创且便于获取等优点，是一种很有前景的生物体液，可以促进AD生物标志物研究的多样化。加拿大皇家科学院厉良教授采用高效化学同位素标记（High Performance-Chemical Isotope labeling，HP-CIL）代谢组学技术，收集认知正常(CN)、轻度认知障碍(MCI)和阿尔茨海默病（AD）人群的唾液样本，进行全面代谢组学分析，探索与AD相关的潜在生物标志物。
二、研究路线
本研究使用了HP-CIL代谢组学技术分析CN、MCI和AD人群的唾液样本之间的代谢物差异。其中发现集（DP）：MCI（n=25）、AD（n=22）和CN（n=35），验证集（VP）：MCI（n=10）、AD（n=7）和CN（n=10）。图1为本研究的工作流程。
三、研究结果
01唾液代谢组的特征
我们分析了发现集（DP）中82份唾液样本，共获得了6230个独特的峰对，在50%以上的样品中普遍检测到3801个峰对。根据精确分子量和保留时间，匹配丹磺酰化标准品数据库（CIL Library）79种代谢物，以及使用精确分子量，在MyCompoundID (MCID)数据库识别到3588种代谢物。在神经退行性疾病方面的研究，与现有的唾液、血液代谢组学技术相比，HP-CIL代谢组学技术的整体代谢组覆盖率显著提升。
02多变量统计分析
主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）可以发现组间有一些初始分离，但CN和MCI组间分离不是很明显，表明MCI和CN组间的代谢组学差异低于AD和CN组间；正交偏最小二乘判别分析（Orthogonal projections to latent structures，OPLS-DA）显示三组显著分离，具有高验证参数(R2Y=0.93和Q2Y=0.79)，证明了模型的稳健性；为了观察从不同人群的唾液代谢变化进展，绘制在三组人群的OPLS-DA 3D图，结果表明代谢变化显著，其中MCI组位于中间位置，而AD组距离CN组较远。（图2）
03 AD诊断生物标志物的筛选和验证
图3表明，不同组间OPLS-DA图都有明显的组分离和有效性指标，证实了模型良好的拟合度和预测能力。在AD与CN比较的火山图中，AD组与CN组有175种显著差异代谢物，AD组与MCI组有142种差异代谢物，MCI组与CN组有59种差异代谢物（p＜0.01，FC＞1.2）（图4）。结合OPLS-DA和火山图分析的结果，选择在两种分析中都有意义的代谢物，并对其进行受试者工作特征曲线 (receiver operating characteristic curve，ROC)分析。
运用HP-CIL代谢组学技术对验证集样本（VP）进行代谢物检测。在三组27个样本中检测到4157个峰对。其中，50%以上的样品中普遍存在3184个峰对。根据DP和VP的AUC≥0.75标准，分别在AD与CN(n=63)、AD与MCI(n=48)和MCI与CN(n=2)的比较中，识别出许多代谢物，其表现持续良好。其中，确定了区分AD和CN的4种代谢物(苯丙氨酰-丙氨酸、尿毒酸、苯丙氨酰-苯丙氨酸和色氨酸-酪氨酸)，区分AD和MCI的3种代谢物(苯丙氨酰-脯氨酸、丙氨酰-苯丙氨酸、苯丙氨酰-甘氨酸)。
04AD诊断模型的建立和验证
使用MetobAnalyst对DP的三组样本进行两两比较，根据结果开发了诊断模型（表1）。使用前3种代谢物(甲基鸟苷、组二酰苯丙氨酸、胆碱-胞苷)区分AD和CN，DP中AUC=1.000，VP中的AUC=1.000，诊断敏感性为100%，特异性为100%；使用相应的前3种谢物(氨基二酚、葡萄糖半乳糖羟赖氨酸-H2O、氨基丁酸+H2)区分AD与MCI，DP中的AUC=1.000，VP中的AUC=1.000，灵敏度为100%，特异度为100%；使用前2种代谢物(葡萄糖基半乳糖羟基赖氨酸H2O、谷氨酰胺卡尼汀)，区分MCI和CN，DP中的AUC=0.779，VP中的AUC=0.889，敏感性为100%，特异性为70.0%。在两两比较中观察到的两个小组(CN与AD和MCI与AD)的辨别性能大大好于第三个小组(MCI与CN)。
表2为使用明确代谢物建立了诊断模型列表。结果表明，使用三种明确代谢物苯丙氨酰-脯氨酸、苯丙氨酰苯丙氨酸和尿囊酸的生物标志物组合区分AD和CN，在DP和VP中产生的AUC值分别为0.820和0.814，敏感性为71.4%，特异性为90.0%；使用丙氨酰-苯丙氨酸和苯丙氨酰-脯氨酸组成的双标记物对区分AD和MCI，DP组AUC值为0.881，VP组AUC值为0.786，敏感性为71.4%，特异性为80.0%。
为了检查VP数据的结果，我们对DP和VP组合的数据集执行了另一组ROC分析，同时分析这两个数据集提供了一种间接的方法来交叉验证此前发现的生物标志物面板性能。在表1和表2中展示AUC、灵敏度和特异度结果的总体分析。图5和图6显示ROC曲线和排列测试。在所有情况下，排列测试结果都是显著的(p<0.01)。对原始验证数据的这种全样本检查表明，表1和表2所示的生物标志物小组的表现稳健，发现的潜在生物标志物可有效进行不同人群的区分。
05代谢通路
在AD与CN和AD与MCI的比较中，有6个二肽显著失调。唾液中显著上调的二肽可以作为诊断生物标志物，能够有效区分AD组和CN组，甚至AD组和MCI组。在DP与VP中，AD组与CN组也检测到尿毒酸有一致的变化。本研究还发现AD患者唾液中尿毒酸水平失调，其尿毒酸浓度是CN组的3倍，这种差异可能是由于尿毒酸代谢的物种特异性所致。然而，唾液中尿原酸的失调支持了AD患者组胺能系统潜在的生物学紊乱，并表明了免疫调节和炎症过程在AD进展过程中的重要性。
四、研究结论
本研究采用HP-CIL代谢组学技术对唾液样本进行系统分析，构建了一种使用唾液发现AD的诊断生物标志物的方法，高质量的数据结果突出了其在AD研究中的重要作用，结合机器学习开发的潜在生物标志物有望实现AD的精确鉴别诊断。
