CRISPR/Cas系统的新星1——Cas12a
CRISPR/Cas系统自发现至今在生物领域掀起了巨大的研究热潮，目前研究最为深入的是前几期内容介绍的CRISPR/Cas9系统。随着应用的不断拓宽，固定的PAM基序以及Cas9蛋白本身特性的一些限制条件，如蛋白大小等，对CRISPR/Cas系统的应用造成了局限性。越来越多的Cas9变体以及新的核酸内切酶被发掘，以拓宽Cas酶系列研究工具。目前已发现的Cas酶亚型共计33个，分为2个大类、6个不同类型。今天小编带来的是近几年研究正热的Cas12a蛋白的相关应用，目前Cas12a(Cpf1)与crRNA形成的核糖核蛋白（RNP）直接转移到细胞中的方法具有更安全、更快、脱靶效应更低、编辑效率更高等优点。
图1. 两类CRISPR/Cas系统，图片来源Makarova KS et al, 2020
CRISPR/Cas12属于2类V型RNA引导的核酸内切酶。该蛋白家族中研究较多是Cas12a核酸酶，目前最常用的Cas12a蛋白来自氨基酸球菌属的BV3L6菌株和毛螺科细菌(LbCas12a)。Cas12a蛋白已被广泛应用于包括细菌、酵母、植物和人类细胞在内的多个物种。
Cas12a蛋白由向导RNA引导剪切带有特异性序列的双链dna(dsDNA)。与Cas9蛋白一样，Cas12a蛋白结构可细分为REC和NUC叶，不同的是Cas12a蛋白的NUC叶缺少HNH结构域，但含有RuvC结构域，用于DNA切割。此外，NUC叶有一个楔形结构域和一个“核酸酶”（NUC）结构域，这两个结构域不能切割DNA。AsCas12a蛋白含有1307个氨基酸，大小与SpCas9蛋白相当。
图2. AsCas12a结构域示意图，图片来源：Yamano T al et，2016
Cas12蛋白的作用机制
在机制上，与Cas9蛋白不同，Cas12a蛋白不需要tracrRNA进行pre-crRNA加工，也不需要RNaseIII。Cas12a的WED结构域中存在核糖核酸酶位点，允许将pre-crRNA自主加工为成熟的crRNA。Cas12a的crRNA明显短于Cas9向导RNA（sgRNA或crRNA+ tracrRNA）。这允许紧凑的Cas12a CRISPR阵列，可用于同时靶向多个位点。
Cas12蛋白只需要识别crRNA就能有效切割单链DNA和双链DNA。Cas12蛋白的RuvC和核酸酶叶(NUC)结构域具有裂解活性。与Cas9相同，Cas12a在PAM（5’-TTTV-3’， V为A/C/G）序列旁边存在一个潜在靶点，一旦与Cas12相遇，就可以启动R-loop，在crRNA和目标DNA链之间形成碱基对杂交，匹配目标序列的1～17个碱基对，形成R-loop。一旦R-loop形成，Cas12a蛋白利用其活性RuvC结构域，在PAM序列的帮助下切割非目标链。Cas12a蛋白的切割功能被激活后，会切割周围的非特异性单链DNA，这种现象被称之为反式切割。
图3. CRISPR/Cas12机制示意图。图片来源：Swarts DC al et, 2017
与Cas9产生平末端相比，Cas12a产生交错粘性末端可能更有利于以精确方向整合DNA序列等应用。CRISPR-Cas12a基因编辑系统可作为Cas9系统的极大补充，甚至在某些编辑领域中比Cas9系统更具优势。
图4.Cas12a与Cas9作用形成的端口，图片来源：Barrangou R al et，2017
Cas12a系统的优势：
a. CRISPR-Cas12a系统拓展了CRISPR-Cas9系统不可用的编辑位点，且能在序列5’端产生交错切割。这相比CRISPR-Cas9系统，显著增加了细胞选用同源重组修复（HDR）方式的概率，提升了基因编辑效率。
b. Cas12a识别富含胸苷的PAM 序列，能够在具有丰富AT基因组的生物体中进行基因组编辑，比CRISPR-Cas9系统更具广泛的序列编辑范围。
c. 只需要crRNA与Cas12a蛋白的简单复合而不需要tracrRNA，且Cas12a的crRNA较短，一般在40-44nt左右（包含一个20nt的恒定区和一个20-24nt的特异性结合区域），更有利于化学合成。
Cas12a蛋白的应用
CRISPR/Cas诊断工具，称为基于Cas12a蛋白的DNA内切酶靶向CRISPR反式报告基因(DETECTR)。DETECTR技术使用V型酶（如Cas12a）切割单链DNA序列，分为三个阶段：（1）将Cas12a蛋白和靶crRNA整合进DNA报告探针中，一旦crRNA通过Cas12a蛋白识别其靶序列，Cas12a蛋白就会在激活切割能力后，靶向切割单链或双链DNA；（2）靶DNA探针与荧光团和猝灭分子结合；（3）DNA探针降解释放荧光团和猝灭剂，产生强大的荧光信号，用于检测靶向单链或双链DNA的切割情况。该系统甚至可以检测到单个病毒颗粒分子。例如，DETECTR被用于检测SARS-Cov-2病毒。Mammoth Biosciences公司以SARS-Cov-2病毒的两个核衣壳（N）和包膜（E）基因为靶点，在1小时内更快地检测到了病毒，生成特异性靶向SARS-CoV-2的Cas12a-gRNA，并优化了E和N基因的DETECTR检测。研究结果表明，基于CRISPR/Cas12系统可高效、快速诊断COVID-19。Cas12核酸酶的这些应用使科学家们能够扩大基因组编辑在各个领域的范围，包括诊断新型病毒。
图5. DETECTR系统机理图，图片来源：Fang L al et, 2023（RPA：重组酶聚合酶扩增）
用于基因组编辑的CRISPR/Cas12系统的快速发展，对生命科学具有重要意义。尽管这项技术的应用领域很广泛，但CRISPR/Cas12系统仍存在一些缺陷。例如，尽管该系统被证明在HDR型DNA修复方面占据很大的优势，但其有效性仍取决于细胞类型。通过HDR的DNA修复通常与细胞分裂有关，这使得这些基因编辑工具在分裂不活跃的细胞（如神经元）中工作效率低下。但该系统具备的广泛适用性，使有关于Cas12a以及其他Cas12家族成员的相关研究数量都正处于高量上升的状态。
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