流式细胞术（二）

一、流式细胞术- 应用

1、细胞生物学研究

    流式细胞术可用于测定细胞周期各时相细胞的百分比。通过测定细胞群体中每个细胞的DNA含量，得出DNA含量分布曲线。

    例如，在测定Hela细胞DNA含量分布曲线上，第一个峰是含有2CDNA含量的G1/G0（DNA合成前期/静止期）细胞。

    其次一个峰是4CDNA含量的G2+M(DNA合成后期＋有丝分裂期)细胞，从2C～4C间的区域为S期（DNA合成期）细胞。采用绘图法或计算机拟合法可计算出细胞周期各时相细胞占整个细胞群体的百分数。

用流式细胞术可进行多参数分析，即同时测定一个细胞的多种性质。

如散射光和荧光，或多种不同颜色的荧光。

例如细胞经吖啶橙染色后，DNA发绿色荧光，RNA发红色荧光。

    测定这两种荧光就能同时得知一个细胞内的DNA和RNA含量。测定结果可用二维散点图或三维立体图表示。用这种方法可根据DNA和RNA含量而鉴别出G0与G1、M期和 G2期细胞。用流式细胞术与液体闪烁技术相配合,还可求得细胞通过G1、S和G2+M期的时间(T、Ts、T+M及其变异系数。

    近年利用抗溴脱氧尿苷(Brdurd)单克隆抗体能发现渗入到细胞 DNA内的溴脱氧尿苷。将此种荧光抗体技术与测定细胞 DNA含量相结合，是研究DNA合成和细胞周期的一种非常有用的技术。

    此外,流式细胞术还可测定细胞群体同步化的程度和所处的时期，鉴别死细胞和活细胞，利用荧光标记配体，还可定量测定细胞表面和内部的受体等。

2、遗传学研究

     用流式细胞术测定染色体DNA含量,可得到染色体频率分布图，称为流式染色体核型分析。

同类型染色体出现一个峰，它的面积代表这种类型染色体的丰度。

    流式染色体核型分析技术不仅能快速分析核型，而且能分选出不同类型的染色体,做成人类每条染色体的DNA文库，可用于人类基因组研究、遗传病和癌症的诊断的研究。

3、免疫学研究

结合免疫荧光方法，流式细胞术可辨认和计数带有不同表面特异性抗原的细胞。

   例如用荧光素标记的免疫球蛋白鉴别T和B淋巴细胞，根据细胞表面抗原的不同,进一步分辨出不同的T和B淋巴细胞亚群，以及测定每个细胞所带抗原的数量、密度及其动力学参数等。也可用流式细胞分选技术将带有“＋”和不带有“－”的某种特异抗原的细胞群体分类收集，供研究其功能特性。

    流式细胞术对于判断免疫缺陷症，如爱滋病（获得性免疫缺损综合征）的重要特征，即T4和T8淋巴细胞比例改变（T4细胞大量减少）以及判断自身免疫病和确定白血病、淋巴癌的表型等，都是非常有用的。

    此外，流式细胞术还可用于定量分析结合于细胞上的荧光素标记的外源凝集素，测定细胞表面积和荧光素结合位点的相对密度，结合细胞动力学测定每个细胞结合位点的数目，以及研究各种外源凝集素与细胞表面结合的竞争性等。

4、肿瘤学研究

    肿瘤细胞一般都含有异常数量的DNA。在大多数实体瘤和急性白血病中都发现有非整倍体的细胞，由于流式细胞术样品制备方法简单，测定结果精确，能快速得到有关DNA倍性的信息,因而能提供有价值的诊断数据。

    如果在测量 DNA含量的同时，再测定其他参数（如不同类型的中等纤维蛋白，蛋白质含量、细胞大小、核质比等）则可进一步提高诊断的可靠性。流式细胞术可在实验和临床中评价肿瘤化疗和放疗的作用，现在根据流式细胞术和细胞动力学数据来监视肿瘤治疗的工作已经在实际工作中开展起来。此外，流式细胞术在血液学、微生物学、分子生物学等领域中也得到广泛的应用。流式细胞术正在向高灵敏、高速度、多参数测量、获取形态学信息等方面发展

二、流式细胞术特点

① 速度快：对单个细胞或生物颗粒进行快速、逐个检测，测量速度可达每秒数千甚至上万个细胞。

② 灵敏度高：每个细胞上只需带有1000~3000个荧光分子即能检测出来。

③ 多参数：多色荧光染色同时分析单个细胞或生物颗粒的多种特征

④ 精度高：在细胞悬液中检测细胞，比其他技术的变异系数更小，分辨率更高

⑤ 纯度高：可以把指定特征的细胞分选出来，分选细胞的纯度可达到99%以上。

⑥ 无害性：能保持细胞不被破坏，进行无害性定性或定量分析和分选。