中大附属第三医院：scATAC-seq探究染色质可及性！9分SCI稳稳把握顶刊风
染色质可及性！这不是顶刊常客吗？今天小云在PubMed挖掘到一篇SCI，9分SCI牢牢把握顶刊的风向！染色质可及性在nature、nature reviews等多个期刊都多次出现，这仿佛掌握了流量密码！
那么就让小云来解密这个流量密码！首先先解释一下：染色质可及性就是指染色质的物理压缩程度。其实通俗易懂的讲解就是这个过程类似于将一份压缩文件（封闭染色质）进行解压（开放染色质）后才能看到具体的文件内容。为了研究细胞里染色质的结构和功能之间的关系，需要分析活跃的开放区域。目前，研究染色质可及性主要是通过将酶切法或物理方法与下一代测序技术结合起来，来检测染色质开放或受保护的区域。常用的方法之一包括转座酶可及性测序（assay for targeting accessible-chromatin with high-throughout sequencing，ATAC-seq）。
这篇SCI通过结合scATAC-seq（这可是单细胞的ATAC，比一般的ATAC还要更加深入到细胞亚群哦！）和来自PDX细胞衍生小鼠模型的配对CRC原发性和肝转移样品，揭示了CRC细胞在转移到肝脏期间以单细胞分辨率的动态调节状态的景观。证明了肿瘤细胞在表达水平和表观遗传调控水平上都具有高度异质性。这篇SCI还挖掘了多种数据集，这些数据集由多种技术生成，包括scRNA-seq，Bulk RNA-seq，微阵列和蛋白质组学！ 总结一下这篇SCI，会发现这篇SCI是非常具有优势的！首先可以肯定的是研究还是比较有广度和深度的！利用scATAC-seq并整合来自scRNA-seq，微阵列，RNA-seq，IHC染色以及蛋白质组学的等多种数据集从不同方面以及不同层次进行分析探究！其次，这篇SCI可以很好把握顶刊风向！手握热点肿瘤转移，染色质可及性还是国自然热点之一！在加上多种新颖测序手段！在逻辑上、选题以及探究手段上都优势！这不就是优势的解题思路吗？
（ps:不知道如何找切入点或创新升级的可以找小云！）
题目：结直肠癌肝转移中的染色质可及性动力学：揭示单细胞分辨率下的肝嗜性
杂志：Pharmacological Research
影响因子：IF= 9.3
发表时间：2023年9月
研究背景
肿瘤转移导致超过90%的癌症相关死亡，目前没有可用的治疗方法针对它。然而，在这个复杂的过程中，对基因的表观遗传调控的理解有限。肿瘤被认为具有异质性，可以在不同的微环境中存活。由基因组不稳定性、癌症干细胞的细胞分化以及不同肿瘤区域的微环境选择性压力引起的随机突变被认为是驱动肿瘤内异质性的可能机制。然而，基因组、表观基因组、转录组和蛋白质组水平的单细胞谱将增强我们对调节从原代肿瘤细胞向转移性肿瘤细胞过渡的机制的理解，并可能指导治疗决策。在单细胞水平的技术中，scATAC-seq可能为调控网络的细胞变异提供新的见解。
数据来源
研究思路
通过整合单细胞ATAC-seq（scATAC-seq），单细胞RNA-seq（scRNA-seq），微阵列，批量RNA-seq，免疫组织化学（IHC）染色，以及来自配对原发性和肝转移性结直肠癌（CRC）患者来源的异种移植（PDX）模型和患者的蛋白质组学数据集，发现肝转移性CRC细胞失去了结肠特异性染色质可访问位点，但获得了肝脏特异性位点。重要的是，观察到肝转移性CRC细胞中HNF4A（一种肝脏特异性转录因子）的可及性升高。随后，对肝转移性CRC细胞与参与肝脏发育的细胞进行了聚类分析，揭示了肝转移性CRC细胞之间的显著异质性。超过50%的肝转移性CRC细胞表现出与红系祖细胞和肝细胞相似的特征，显示出参与氧化磷酸化和糖酵解的基因表达增加。此外，这些发现进一步揭示了这些细胞中的MHC和IFN反应基因表现出适度的表观遗传活性，这与检查点阻断免疫治疗中的低客观反应率显著相关。研究结果揭示了HNF4A的关键作用，肝转移性CRC细胞内的细胞群可能作为解决肝转移和改善CRC患者免疫治疗反应的关键治疗靶点。
主要结果
1. 单细胞分辨率下配对原发性和肝转移性结直肠肿瘤的染色质景观 为了全面评估不同细胞类型的顺式调节变异，使用10X Genomics平台进行了单细胞染色质可及性(scATAC-seq)分析(图1A)。从从小鼠新鲜切除的3对原发肿瘤样本和肝转移肿瘤样本中分离出单细胞(图1B)。在这些小鼠中，在盲肠处进行了PDX CRC细胞HCC022的原位注射(图1A)。总共获得了43650个单细胞，包括39131个人类细胞和4519个小鼠细胞，这些细胞分别映射到人类和小鼠基因组(图1C)。为了特别关注肿瘤细胞的进展，并消除来自其他细胞的潜在污染，将进一步分析仅限于人类细胞(图1A)。经过质量控制和过滤，总共保留了17,924个高质量单细胞，包括来自原发肿瘤的7254个细胞和来自转移性肿瘤的10670个细胞(图1B)。在残留肿瘤细胞的集成投影仪上进行了基于图的聚类和统一流形近似和投影(UMAP)分析(图1D)。聚类后，确定了15个不同的肿瘤亚群(图1D)。为了确定每个细胞簇中的细胞特征，分析了每个细胞簇中细胞的可及染色质区域，并如前所述识别了细胞簇中解除调控的基因(图1E)。确定的细胞簇特异性的失调基因涉及各种生物过程，如簇0中的细胞生长和增殖(AZIN2)，簇7和簇8中的DNA修复(PCNA)，簇1中的肿瘤抑制(TFPI2)和簇6中的细胞-细胞黏附(CDH11)(图1E – 1F)。 转录因子(TFs)在细胞发育和肿瘤进展中起着至关重要的决定作用。接下来，分析了每个簇中TFs的染色质可及性(图1G)和基序偏差(图1H)。观察到500个顶级可变TFs的基因活性和基序富集的簇特异性模式(图1G- 1H)。分析表明，在结直肠癌肝转移过程中，肿瘤细胞的染色质调控网络具有高度异质性。
图 1 原发性和肝转移性CRC中癌细胞的单细胞染色质可及性景观
1. 原发肿瘤与肠上皮关系提示干细胞样细胞的恶性 为了揭示CRC细胞和成人肠上皮之间的关系(图2A)，将来自作者的scATAC-seq数据的原代CRC细胞与来作者自已发表的scRNA-seq数据集的正常肠上皮细胞聚类(图2A- 2B)。在正常肠上皮中，7种成熟细胞类型均被鉴定(图2C)。值得注意的是，原代CRC细胞群(簇0)与正常肠上皮中的干细胞和杯状细胞群很好地聚集在一起(图2B-2D)。 为了更好地了解原代CRC细胞和正常肠上皮细胞之间的相似性，使用肠上皮细胞的顶部标记基因对原代CRC细胞进行聚类（图2E）。在原代CRC细胞的簇中，簇0表现出与干细胞样细胞（ISC，祖细胞，TA细胞）和内分泌细胞（杯状，肠内分泌细胞）相似的特征，簇7显示出TA标记基因富集，簇5,3,2类似于肠细胞，簇9,4,10,12与Paneth样细胞相似（图2E）。然后，根据聚类模式确定了初级CRC单元中的三个主要模块（图2E-2F）。模块A，占原代CRC细胞的30%（图2F），表达参与干性的基因（HGMB2，TOP2A，FOXM1，ASCL2等）（图2G）。 与模块A相比，模块B显示出更高的可及性和参与脂肪生成，脂质积累以及肝脏脂质代谢的调节因子（如CEBPA）的明显足迹（图2 G-2H）。与模块A和B不同，模块C代表更高的可及性水平和参与IFN-γ反应（IRF1）的基因的显著足迹（图2G-2 H）。特征分析进一步表明，与其他模块相比，模块A在参与多种癌症进展过程（包括去分化、增殖和EMT）的基因中表现出更高的可及水平（图2I）。然后，研究了模块A的特征是否与临床结局相关。为了解决这个问题，分析了模块A的特定基因，其数据集存放在ArrayExpress，GEO，TCGA和HPA 数据库中。正如预期的那样，与正常样品相比，两个模块A高度可及的基因HMGB2和HMGA1（TA细胞的标记）的IHC染色在CRC样品中显示出显著更高的蛋白质水平（图 2J-2K）。原代CRC细胞保留了肠上皮细胞的几个特征，而那些类似于具有干性的细胞的细胞表现出较差的临床结果，并且与其他亚克隆相比可能是高度恶性的。
图 2 CRC细胞反映了原发性肿瘤进展过程中的细胞状态转变
1. CRC 细胞失去了结肠细胞特异性染色质可及位点，但在肝转移过程中获得了肝细胞特异性位点 为了确定在CRC细胞转移到肝脏的过程中转录重编程是如何调节的，根据其样本类型（图3A-3B）划分每个簇，并计算它们在原发性或肝转移肿瘤样本中的比例（图3C-3D）。与原发肿瘤相比，肝转移肿瘤中第1、6、8簇的比例增加，第0、3、4簇的比例降低（图3D）。结肠和肝脏特异性基因的GSEA分析表明，肝转移CRC细胞的肝脏特异性基因显著富集（SARDH，LIPC等），但结肠特异性基因的负富集（RNF186，LEF1等）（图 3E）。通过分析包括133个原发性和转移性CRC组织样本的体积微阵列数据集进一步证实了这一结果（图3F-3G）。 然后分析结肠和肝脏特异性基因启动子染色质可及性的动态，发现在假时间依赖性癌症进展过程中，结肠特异性基因启动子的可及性逐渐降低，而肝脏特异性基因启动子的可及性逐渐增加（图3H）。相对于肝脏特异性基因（SARDH）,来自块RNA-seq和微阵列的表达谱显示结肠特异性基因MEIS1的表达从邻近的正常结肠组织降低到原代CRC组织，再到肝转移CRC组织（图3 I-3 J）。 有趣的是，观察到参与二羧酸转运（一种结肠特异性代谢途径）的基因（SLC26A3等）的可及性逐渐丧失（图3K），而参与脂质代谢（肝脏特异性代谢途径）的基因（PROX1，ABCD1等）逐渐获得（图3K）。在这两种代谢途径中，所选基因的表达水平也从正常组织变为原发性CRC组织，以及肝转移CRC组织（图3L-3M）。总之，数据表明，CRC细胞在单细胞分辨率的肝转移过程中失去了结肠细胞特异性的表观遗传特征，但获得了肝细胞特异性特征。
图 3 与原发肿瘤相比，单细胞染色质可及性数据定义了肝转移性CRC肿瘤中不同的癌细胞状态
1. 肝转移癌细胞获得肝脏特异性顺式调节程序，但失去结肠特异性程序 考虑到TFs对于细胞命运决定至关重要，为了探索CRC细胞在肝转移过程中的命运，鉴定了原发性和肝转移样品中差异偏差的基序（图4A），并将CRC细胞与这些差异偏差的基序分组（图4B）。因此，15个CRC簇可分为三大类：类磷（富磷TFs高度可及的簇）、类LM（富集LM的TFs高度可及簇）和中间簇（图4B）。此外，对于原代CRC细胞中的结肠特异性转录因子（LEF1，IRF1，NFATC2和AP-4等），观察到一组编码肝脏特异性转录因子（HNF4A，FOXA2等）的基因在肝转移CRC细胞中显著富集（图4C-4D）。scRNA-seq（图4E）和mRNA水平的体微阵列分析（图4F）进一步证实了这一观察结果。每个细胞中的基序富集（图4C），每个簇中位点特异性基因的覆盖分析（图4 D）和脚印（图4G）以及基序富集揭示了HNF家族和FOXA家族在肝转移中的显著富集。 利用从scATAC-seq数据预测染色质结构的最新进展，分别在原代和肝转移CRC细胞中鉴定了26999和57550个共可访问的染色质区域，包括结肠特异性转录因子（如原代CRC细胞中的GPX2，IRF1）启动子的相互作用（图4H）和肝脏特异性转录因子（如HNF1A），肝转移细胞中的HNF4A和FOXA2（图4I）。有趣的是，观察到可访问染色质区域（ACR）的交互能力随着组织特异性方式的增加而增加（图4H-4I）。例如，HNF4A和FOXA2在肝转移CRC细胞中表现出优先共通性，与最大数量的HNF4A近端 - 远端ACR峰一致（图4D），以及组织特异性远端共通链接相互作用（图4I）。假设具有扩展交互能力的ACR类似于具有影响性状潜力的增强子。这些结果表明远端增强子及其靶基因在原代和肝转移CRC细胞中具有不同的组织特异性调控构型。综上所述，数据表明，CRC细胞失去了结肠细胞特异性顺式调节程序，但在肝转移过程中获得了肝脏特异性程序。
图 4肝转移癌细胞获得了肝脏特异性顺式调节程序，但失去了在单细胞分辨率下定义的结肠特异性程序
1. 肝转移CRC与肝细胞的关系揭示了兼具肝细胞和红系祖细胞特征的细胞的恶性 考虑到转移性CRC细胞类似于肝细胞，随后的目标是确定它们在肝脏谱系层次结构中模仿的精确细胞类型（图5A）。将scATAC-seq数据的转移性CRC细胞与scRNA-seq数据中的正常肝组织的细胞聚集在一起（图5B），发现肝转移CRC细胞模仿多种类型的肝细胞（图5C-5D）。当将这些正常肝细胞聚类到转移性CRC细胞时，也获得了类似的结果。UMAP结果表明，簇1和簇6的一部分与肝细胞重叠，簇1的其他部分与成红细胞和肝细胞接近，但簇6的另一部分与成红细胞和红系祖细胞重叠（图5D）。簇11、14、7和8与红系祖细胞重叠，簇0与成红细胞重叠（图5D）。通常，观察到与肝细胞重叠的簇都属于LM样簇（图4B，图5D），中间簇接近肝细胞，但远离其他类型的肝细胞;与LM样簇和中间簇相比，P样簇远非所有类型的肝细胞（图4B，图5D）。 然后，使用肝脏发育中细胞的顶级标记基因对所有这些肝转移CRC细胞进行聚类，并根据scATAC-seq（图4E）或scRNA-seq的聚类结果定义8个模块。模块1和模块2分别类似于红系祖细胞和肝细胞，模块3由与其他肝细胞相似的细胞组成，模块4类似于红系祖细胞和肝细胞（图5E）。使用参与癌症进展的几个基本过程（图5 F）和基因进一步比较了这些模块，发现模块1和4是高度恶性的，因为它们在许多过程中得分更高（图5 F），并且表达更多的基因与癌症进展有关。
图 5肝转移癌细胞反映了干到红系祖细胞表观遗传状态的连续统一体
1. 四个恶性细胞程序表现出不同的免疫反应特征 免疫疗法是一种很有前途的疗法，旨在激活人体的免疫系统来对抗癌症。癌细胞释放的趋化因子和癌细胞中表达的表面抗原都会影响免疫治疗的效果。为了更好地了解癌细胞中活跃的细胞程序，这些程序可能驱动与免疫系统的相互作用，接下来分析了上述四个模块与免疫治疗中涉及的几个过程之间的关联，包括免疫系统和免疫微环境的激活以及PD-1相关检查点，跨越肝转移CRC细胞的所有簇（图6A-6G）。MHCs和IFN-γ反应相关基因的表达水平是免疫应答的关键指标。发现模块1和4中的亚克隆表现出相对较低的MHC表达和较弱的IFN-γ反应（图6A-6B）和较高的增殖速率（图6A和6C），而模块2和3中的亚克隆表现出相对较高的免疫应答水平（图6A-6B）。相对评分显示，模块1和4中的亚克隆可以释放免疫抑制分子（图6D-6E），并可能通过改变β-连环蛋白信号传导来损害效应T细胞的运输（图6F），模块3中的亚克隆可以释放CXCL10以募集Th1极化效应T细胞，并且对免疫应答的抑制水平相对较低（图6检查点分析的结果也与这些结果相似（图6D）。总的来说，这些结果表明模块1和4中的亚克隆可能对免疫治疗具有耐药性，因此与其他亚克隆相比更恶性。这四个恶性细胞程序在癌症进展、代谢和免疫反应信号传导方面的差异促使在大型前瞻性队列中研究它们是否在疾病进展和治疗耐药性中发挥不同的作用。然后，利用我们的scATAC-seq数据生成癌细胞特异性特征，并使用模块相关基因对两个已发表的蛋白质组学数据集进行评分，包括CRC患者的肝转移性CRC样本（图6H）或CRC患者的原发性样本。发现模块3和模块2评分高的患者表现出较低的增殖率表达水平，MHCs和IFN-γ反应和T细胞毒性相关基因的表达水平较高，表明这些患者可能对免疫治疗有积极反应（图6H）。相反，模块1和4评分高的患者表现出相对较低的免疫反应基因表达水平（图6H）。
图 6 在肝转移癌细胞中表达的模块相关基因可预测临床免疫治疗反应
1. 癌症患者模块相关基因评分的临床意义 接下来，研究了这些癌细胞程序在ICB治疗背景下对免疫细胞的潜在影响。模块1和4表现出较低水平的MHCs、IFN-γ反应和T细胞细胞毒性，与应答者相比，ICB无应答者的得分更高，而模块3则表现出相反的趋势（图6I）。进一步针对其他癌症类型的九个数据集查询了模块相关基因，并根据用于生存分析的模块基因标记的平均表达将患者定义为高或低模块评分（图6J-6L）。.总生存分析结果显示，模块1和4相关基因可预测生存率差，模块2和3相关基因可预测更好的预后，少数例外（图6J-6 L）。总之，的结果表明肿瘤细胞与肿瘤微环境之间存在复杂的相互作用，四个癌细胞群在肿瘤进展和/或ICB治疗中呈现不同的信号。
文章小结
这篇SCI整合包括23个队列，包括777名患者，通过利用多种技术，阐明了有利于肝嗜性的表观遗传转变及其对单细胞分辨率下肝转移性CRC细胞中免疫反应，代谢和恶性肿瘤的异质性的影响。这些发现可能为CRC患者的肝转移和增强免疫治疗反应提供必要的治疗靶点。总之，这篇SCI可以说要热点有热点，要技术有技术，要逻辑有逻辑！所以这篇SCI还是非常值得大家学习！
