细胞培养（五）

写在前面：细胞培养的常规步骤就包括细胞复苏，细胞传代和细胞冻存，本期内容主要介绍一下细胞冻存；

细胞冻存的作用：将细胞置于-196°C液氮中低温保存，使细胞暂时脱离生长状态但仍然保持细胞特性，起到细胞保种的作用；在此过程中需要用到细胞冻存液，冻存管，冻存盒；

冻存液的配制（ 4°C冰箱放置，现配现用）

DMSO：血清=1:9

DMSO：血清：培养基=1:2:7

（DMSO：降低溶液冰点，并在缓慢冻结条件下，快速进入细胞，使细胞内水分透出，减少冰晶的形成，避免细胞损伤；）

细胞冻存步骤图解

详细步骤如下

• 取出培养的细胞，收集细胞悬液，贴壁细胞的话，就需要进行胰酶消化处理；

• 之后离心，去掉细胞培养基，有条件的实验室，可对细胞进行计数，一般细胞冻存的数量需要大于2E6个/mL；

• 计数后，使用冻存液重悬，比如你有1E7个细胞，按照2E6冻存，你就可以冻存5管，就需要加5mL冻存液重悬，但为了吹散细胞，通常可以先加1mL冻存液，轻柔的把细胞吹散，再补足5mL混匀，之后分装到冻存管中；

• 标记①细胞名称 ②冻存密度（≥2E6个/ml）③代次 ④培养基类型 ⑤冻存人姓名 ⑥冻存时间；

• 放入复温的冻存盒，-80℃进行降温，暂存可放于-80℃，长期保存需要转移至液氮罐；

细胞冻存的注意事项

细胞冻存液最好现配现用；

冻存细胞必须处在对数生长期，细胞活率大于90％；

冻存的细胞要保证无微生物污染，冻存前做支原体检测；

细胞浓度控制在：1×10^6－2×10^7/ml，具体数量因细胞种类而异，太低的细胞浓度会影响后期细胞的复苏；

最好使用程序降温盒，每分钟下降1℃，遵循“慢冻”原则；

冻存记录要表明细胞的种类、冻存之前的状态和大致数量、冻存时间和操作者；

冻存的细胞应尽快转入液氮，不要在-80℃冰箱放置超过两个月；

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