【小分子新药研发与原料药CMC】其十 杂质研究专题

杂质研究是小分子原料药质量研究的一个重要组成部分。ICH在Q3指导原则与M7指导原则中，着重介绍了原料药杂质研究的技术细节。[1]本篇文章对于Q3、M7指导原则的相关内容进行概括性地介绍，也是本教材的最后一篇内容。

ICH Q3指导原则分为四部分，它们分别是：Q3A（原料药中的杂质概述、有机杂质）、Q3B（制剂中的杂质概述）、Q3C（溶剂残留）、Q3D（元素杂质）。ICH M7指导原则着重介绍基因毒性杂质的判定与控制策略。我们在本文中分小节逐次介绍除Q3B指导原则以外的其他所有主题。

1.     ICH Q3A–原料药中的杂质概述、有机杂质

1.1 原料药中的杂质概述

在Q3A指导原则中，杂质被分为了三大类：与工艺和药物结构相关的有机杂质、无机杂质、残留溶剂。[2]需要注意的是，Q3A并没有对于存在于小分子原料药的规格中的所有杂质进行讨论，这包括：外源性污染物（如微生物与内毒素）、多晶型（polymorph）、对映异构体杂质。

1.2 有机杂质–特定杂质与非特定杂质

对于有机杂质而言，它的来源包括：1）起始物料；2）工艺过程中的副产物；3）工艺过程中的中间体；4）原料药与其他杂质的降解产物；5）试剂、配体、催化剂。除了在工艺化学研发阶段获得原料药有机杂质的主要信息之外，原料药稳定性测试[3]之中的降解产物、强降解产物也需要被杂质研究关注。

理论上，一个原料药在生产纯化之后，携带的在1 ppm级别以上的有机杂质种类非常多，但不是所有有机杂质都需要在规格上单独列出、在放行过程中单独检测。因此，根据是否单独列入规格的检测项，我们可以对于各种杂质区分为：特定杂质（Specified Impurity）与非特定杂质（Unspecified Impurity）。[4]

特定杂质与工艺过程有稳定的关联性，引起研发过程的持续关注：通常情况下，特定杂质都是已鉴定杂质，但单独出现在规格检测项里面并不意味着必须将其成功鉴定。对于非特定杂质而言：它们在原料药产品中存在的种类、概率、量级（对于原料药而言，非特定杂质含量一定要小于鉴定限度）很小；且人们通过安全性研究，可以判断这些非特定杂质足够安全。

对于非特定杂质，在规格中也可以将其称为单项杂质（Single Impurities）对其限度进行统一控制：例如，技术人员对某中间体的规格有一项“单项杂质不大于0.5%”的描述，其含义就是“所有非特定杂质HPLC纯度均不大于0.5%”。

1.3 有机杂质–报告限度、鉴定限度、界定限度[5]

对于原料药中的杂质，人们会根据原料药的每日摄入量（Total Daily Intake，TDI）设定三个限度：报告限度（Reporting Threshold）、鉴定限度（Identification Threshold）、界定限度（Qualification Threshold）。ICH Q3A的附件一明确了根据不同TDI设定的三个限度的数值。

对于超出报告限度的杂质，均应在检测报告中报告该杂质的具体数值。对于超出鉴定限度的杂质，均应对其结构进行鉴定。

对于超出界定限度的杂质，一般人们认为该杂质对使用者的健康有安全性的顾虑。这时，研究主体需要对该杂质进行安全性的进一步研究：[6]或使用纯化手段将杂质水平降至安全限度以下、或经过安全性试验证明该杂质水平即便较高也不会产生风险，两种方式均可使原料药产品质量得到控制。关于更详细的杂质控制策略，ICH Q3A的附件三明确了对于杂质鉴定和界定相关的决策树。

1.4 在质量标准中的杂质检测项目（ICH Q3A第6节）

ICH Q3A对于小分子原料药规格里，杂质的检测项目做了明确说明：以下是ICH Q3A的原文摘录。

新原料药质量标准中应包括以下杂质检查项：

1）有机杂质：每种特定的已鉴定杂质、每种特定的未鉴定杂质、任何不大于(≤)鉴定限度的非特定杂质、杂质总量；

2）残留溶剂；

3）无机杂质。

2.     ICH Q3C–残留溶剂

ICH Q3C指导原则将残留溶剂定义为：在原料药或辅料的生产中、以及制剂制备过程中，使用或产生的有机挥发性化合物。人们对于工艺路线中常用的溶剂类型，都收集了足够充分的毒理学数据、从而推导出相应的每日允许暴露量（Permitted Daily Exposure，PDE）。根据溶剂对于人体和环境的危害程度，工艺路线中常用的溶剂被分类为1类、2类、3类溶剂。

1类溶剂是应在工艺过程中避免的溶剂：它们是已知的人体致癌物、强疑似人体致癌物、环境危害物。1类溶剂包含：苯、四氯化碳、1,2-二氯甲烷、1,1-二氯乙烯、1,1,1-三氯乙烷。如果在工艺中不得不使用这些溶剂，它们在原料药产品中的浓度限度（除1,1,1-三氯乙烷外）均在10 ppm以下。

2类溶剂是应限制的溶剂：它们是非遗传毒性动物致癌物、可能导致其他不可逆毒性（如神经毒性或致畸性）的溶剂、可能有其他严重但可逆的毒性的溶剂。应限制2类溶剂在制剂中的使用。对于原料药而言，如果在工艺路线中使用了2类溶剂，则原料药检测标准中的2类溶剂残留都有相应的浓度限度。ICH Q3C在其4.2节说明了每种2类溶剂的浓度限度。

3类溶剂可视为低毒、对人类健康危害风险较低的溶剂。如果工艺路线允许，应尽量在工艺过程中使用3类溶剂。在原料药检测标准中，通常无需将特定类型的3类溶剂标明：所有3类溶剂加和含量占比小于0.5%（5000 ppm）即符合安全性标准。

举个例子，如果一条工艺路线在合成原料药的过程中使用了两种2类溶剂（乙腈、甲醇），使用的其他溶剂均为3类溶剂。则原料药标准关于残留溶剂的规格设置可以这样考虑：乙腈（410 ppm，GC方法测定）、甲醇（3000 ppm，GC方法测定）、干燥失重不大于0.5%。

3.     ICH Q3D–元素杂质

在生产原料药的过程中，元素杂质的来源包括：原料药工艺过程（如金属催化剂）、生产过程中使用的水与辅料、包装材料、生产设备等。[7]元素杂质与残留溶剂类似，根据每日允许暴露量（PDE），被分类为1类、2类、3类元素杂质。

与残留溶剂不同的是：药品如果对于人体的给药路径（口服、注射、吸入）的不同，元素杂质在人体中的生物利用度不一样。因此，在不同的给药路径前提下，同一种元素杂质在规格标准中的限度是不一样的。[8]

1类元素杂质在自然界有一定程度的丰度，且为人体毒素。除了在工艺路线中避免使用这些元素之外，也要考察相关元素杂质所有潜在的来源。1类元素杂质包含：砷（As）、镉（Cd）、汞（Hg）、铅（Pb）。

2类元素杂质通常被认为是给药途径依赖型的人体毒素。2A类元素在自然界有一定程度的丰度，因此对所有潜在来源以及给药途径都需要进行风险评估。2A类元素包含：钴（Co）、镍（Ni）、钒（V）。2B类元素在自然界的丰度较低，如不是在生产过程中刻意添加这些元素，通常无需进行风险评估。2B类元素包含：银（Ag）、金（Au）、铱（Ir）、锇（Os）、钯（Pd）、铂（Pt）、铑（Rh）、钌（Ru）、硒（Se）、铊（Tl）。

3类元素口服给药途径的毒性相对较低，但在吸入和注射给药途径的风险评估中仍需考虑。除非有意添加这些元素，否则在口服给药途径的风险评估中不需考虑。3类元素包含：钡（Ba）、铬（Cr）、铜（Cu）、锂（Li）、钼（Mo）、锑（Sb）、锡（Sn）。

在ICH Q3D指导原则中，表5.1详细阐述了在各给药路径条件下，上述三类元素杂质是否需要进行相关的风险评估；附录2介绍了上述三类元素杂质在各给药路径下的每日允许暴露量；而由每日允许暴露量与相应的原料药/制剂每日摄入量的比值，可以直接得出每个元素杂质在原料药/制剂的规格标准中的浓度限度。

4.     ICH M4–基因毒性杂质

在原料药的有机杂质之中，有一类杂质在进入人体之后，可能会与人体的DNA发生反应，从而增加使用者患癌症的概率。这类杂质被称作潜在基因毒性杂质，或是基因毒性杂质（Genotoxic Impurities，GTI）。2018年，华海药业的缬沙坦原料药被检测出含有N-亚硝基二甲胺（NDMA）的基因毒性杂质，[9]引发了业界对于原料药基因毒性杂质、特别是亚硝胺类杂质的又一轮关注。[10]

4.1 每日允许暴露量（PDE）应用于基因毒性杂质的控制策略

对于基因毒性杂质的控制策略，ICH在M7指导原则中专门进行了描述，以作为Q3A、Q3B信息的必要补充。

在Q3C的信息中，我们已经介绍了每日允许暴露量（PDE）应用于残留溶剂的控制策略。溶剂本质上也是一类有机杂质，对Q1A中描述的于有机杂质，我们也可以根据它们的毒理学数据判断相应的PDE，进而推导出合理的控制限度；而且，无论该有机杂质是不是基因毒性杂质，PDE应用于确定控制限度的策略均适用。只不过很多Q1A描述的、伴随工艺产生的有机杂质千变万化（且杂质水平随工艺控制策略的变化而变化），人们有时候无法获得足够多、足够纯的杂质做比较透彻的毒理学研究。

4.2 以辅助性预测方式对基因毒性杂质进行控制

对于伴随工艺产生、且人们详细测定毒理学数据的情况下不够经济的杂质，ICH M7指导原则使用一套辅助性工具预测相关结构的安全性、控制相关杂质的可接受限度。辅助工具包含：警示结构（Structural alert）、定量构效关系（Quantitative structure-activity relationship，QSAR）软件预测警示结构、细菌致突变试验、毒理学关注阈值（Threshold of Toxicology Concern，TTC）等。

警示结构。人们在对于化学物质与人体遗传物质的反应性的研究过程中，总结出了一些官能团有较大的概率与基因毒性相联系，相应的官能团结构便称为警示结构：人们对相关的警示结构以数据库的形式进行了汇总，并不断更新。[11]

QSAR软件预测警示结构。QSAR软件预测是一种借助分子的理化性质参数或结构参数，以数学和统计学手段定量研究有机小分子与生物大分子相互作用、有机小分子在生物体内吸收、分布、代谢、排泄等生理相关性质的方法。[12]QSAR软件预测可以系统地预测化合物是否含有警示结构，ICH M7指导原则推荐“基于专家知识规则”与“基于统计学”两种方法的结合对化合物进行预测：若两种方法判定均无警示结构，则我们认为相应化合物无警示结构。

如果一个有机杂质经历结构鉴定之后，QSAR软件预测无警示结构：我们可以直接预测该化合物无基因毒性。（ICH M7表1中的第5类杂质）。

如果一个有机杂质经历结构鉴定之后，QSAR软件预测有警示结构；但相应警示结构也存在于原料药或中间体的分子结构内；同时，有足够充分的毒理学数据表明，原料药或中间体无基因毒性：我们也可以预测该化合物无基因毒性。（ICH M7表1中的第4类杂质）。

如果一个有机杂质经历结构鉴定之后，QSAR软件预测有警示结构；同时，警示结构不存在于原料药分子结构内：我们将该杂质判定为ICH M7表1中的第3类杂质。该类杂质经过细菌致突变试验，被判断是否是基因毒性杂质。

细菌致突变试验。[13]细菌致突变试验是一种快速检验化合物是否有致DNA突变的试验。通过此试验，人们得知相关化合物是否有对于细菌的基因毒性：第3类杂质在获得相关信息补充后，可以被归为第5类杂质（Ames试验阴性）或第2类杂质（Ames试验阳性）。

上述流程已经介绍了基因毒性杂质相关的5类杂质（ICH M7表1）之中的2～5类。剩下的第1类杂质即为4.1节中提到的、有充分毒理学研究结果证明的基因毒性杂质，应按照相应的PDE推知其可接受限度。这样，5类基因毒性杂质相关的杂质类型之中，我们只剩下第2类杂质进行可接受限度的设定了。

毒理学关注阈值（TTC）。TTC定义了未经研究的化学物质在致癌或其他毒性作用风险可忽略时的可接受摄入量。确定TTC的方法总体上可认为是非常保守的，它是将50%肿瘤发生率（TD50）的剂量简单线性外推到百万分之一发生率而得，且采用的TD50数据取自最敏感物种和对诱导最敏感的肿瘤发生部位产生的数据。[14]ICH对于各种服药周期的药物的TTC，进行了明确的定量限制（ICH M7表2）。第2类杂质即可按照ICH M7表2的约束条件进行可接受限度设定。

如上即为以辅助性预测方式，对基因毒性杂质进行控制的总体策略。

[1] ICH指导原则可以在国家药监局药品审评中心官网上下载：https://www.cde.org.cn/ichWeb/guideIch/toGuideIch/0/1

[2] ICH Q3A第2节

[3] 具体方法参见ICH Q1相关内容

[4] ICH Q3A第6节

[5] ICH Q3A第5节、第7节

[6] 安全性研究的主体为毒理学数据，通过毒理学数据可以得出在本文第2节（Q3C）描述的每日允许暴露量的信息，从而判定超过界定限杂质的安全限度。

[7] ICH Q3D第5.2节

[8] ICH Q3D第4节

[9] 百度百科：华海药业降压药事件

[10] https://www.ema.europa.eu/en/documents/referral/nitrosamines-emea-h-a53-1490-assessment-report_en.pdf

[11] https://publications.jrc.ec.europa.eu/repository/bitstream/JRC52274/eur_23844_en.pdf

[12] 维基百科：定量构效关系

[13] 维基百科：Ames test

[14] ICH M7第3节–总则