艾美捷测序级 II，纯化胰蛋白酶实验室使用的测定方法

测序级 II，纯化胰蛋白酶背景参考：

牛胰腺表达两种形式的胰蛋白酶，主要的阳离子型和次要的阴离子型。这些蛋白质序列具有72%的同一性，而它们的编码区具有78%的同一。

这些蛋白质中的每一种都被进一步加工成不同的形式。催化胰蛋白酶包含一个灵活的“自溶回路”（残基G145-V157）（Schroeder和Shaw 1968，以及Bartunik等人1989），在该回路中的K148-S149处的显性单链形式B胰蛋白酶的自溶导致a胰蛋白酶的形成。K193-D194处的进一步自溶导致Psi胰蛋白酶的形成（Fehlhammer和Bode 1975）。

阳离子和阴离子胰蛋白酶蛋白均表达为胰蛋白酶原原酶，具有15个残基的信号肽（M1-A15）和8个残基前肽（F16-K23）。所有已知胰蛋白酶的三维折叠高度保守。此外，催化三联体和催化三联体侧翼区域高度保守（Hartley 1970）。

艾美捷测序级 II，纯化胰蛋白酶特异性：

胰蛋白酶在赖氨酸和精氨酸氨基酸残基的C端侧切割肽。如果脯氨酸残基位于切割位点的羧基侧，则不会发生切割。如果酸性残基位于裂解位点的任一侧，则水解速率已显示较慢。

艾美捷测序级 II，纯化胰蛋白酶化验方法：

文献中描述了各种测定。Spencer等人（1975）报道了一种使用完整蛋白作为底物的测定，该蛋白上附着有荧光染料1-苯胺-8-萘磺酸盐（ANS）。Stewart（1973）描述了一种使用显色底物N-苯甲酰基DL-精氨酸对硝基苯胺（DL-BAPA）、N-戊酰基-L-苯基对硝基苯胺的方法。Ford等人（1973）报告了使用对硝基-苯基对胍苯甲酸酯（NPGB）测定固定化胰蛋白酶的活性位点暴露，形成了稳定的酰化酶，加上在410nm处测定的对硝基苯酚分光光度法。沃辛顿实验室使用的测定方法如下所述。

在25°C、pH 8.2、0.01 M钙离子存在下，一个单元每分钟水解1μmol对甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯（TAME）。

试剂：

0.046百万特里斯⋅HCl缓冲液，pH 8.1，含0.0115 M氯化钙

0.01 M TAME（对甲苯磺酰基-L-精氨酸甲酯）

0.001 N盐酸

酶：

在0.001 N HCl中稀释至10-20 ug/ml的浓度。

程序：

将分光光度计设置在247 nm和25°C。

按如下方式将移液管移到每个试管中：

0.046百万特里斯⋅HCl缓冲液，pH 8.1 2.6 ml

0.01 M TAME 0.3 ml

在25°C的分光光度计中培养3-4分钟，以达到温度平衡，并建立空白率（如有）。加入0.1 ml稀释酶，记录A247 3-4分钟。从曲线的初始线性部分确定ΔA247。反应保持线性，A247约为0.320。反应应线性至少三分钟。如果不是这样，重复使用更少的酶。