文献解读|不同肿瘤的癌细胞状态复发以及与肿瘤微环境特定的相互作用

期刊：NATURE GENETIC（IF 41.307 ）

技术服务：scRNA-Seq

导语

肿瘤的转录异质性越来越被认为是肿瘤进展、转移和治疗失败的驱动因素。单细胞RNA测序能够对肿瘤单个细胞进行转录组分析，并揭示了同一肿瘤的恶性细胞之间的异质性。针对各种癌症类型的研究也表明，存在与应激反应、干扰素反应和缺氧有关的癌症细胞状态。肿瘤微环境（TME）中特定细胞类型和癌症细胞状态之间也存在因果关系。这些工作促使我们系统地研究TME的肿瘤恶性细胞和非恶性细胞之间的关系。

研究内容

对15种癌症类型进行了泛癌scRNA-Seq分析，并确定了一系列基因模块，这些基因模块的表达定义了复发性癌症细胞状态，包括“应激”、“干扰素反应”、“上皮-间充质转化”、“金属应答”、“基底细胞”和“纤毛细胞”。空间转录组分析将癌症细胞中的干扰素反应与肿瘤微环境中的T细胞和巨噬细胞联系起来。使用小鼠模型，我们进一步发现干扰素反应模块的诱导因肿瘤位置而异，并在淋巴细胞消除后减弱。

研究思路

研究结果

1. 不同癌症类型的重复基因模块

手术收集了19例未经治疗的患者肿瘤，涵盖9种癌症类型：卵巢癌（OVCA）、子宫内膜癌（UCEC）、乳腺癌（BRCA）、前列腺癌（PRAD）、肾脏癌（KIRC）、肝脏癌（LIHC）、结肠癌（COAD）和胰腺癌（PDAC），以及胃肠道间质瘤（GIST）。通过marker基因、singleR注释和inferCNV分析来识别恶性细胞。还对之前发表的肿瘤数据进行了分析，包括：PDAC21、LIHC22、胆管癌（CHCA）、肺腺癌（LUAD）、头颈部鳞状细胞癌（HNSC）肤鳞状细胞瘤（SKSC）、多形性胶质母细胞瘤（GBM）和少突胶质瘤（OGD），共来自62例未经治疗的原发肿瘤样本，15种癌症类型。

使用非负矩阵因子分解（NMF）分析恶性细胞，用基因模块鉴定为共表达基因集。检测样本中共表达的基因组，即在细胞亚群中一致表达的基因。为了在肿瘤中寻找重复出现的基因模块，比较了已鉴定模块的基因组成。尽管在各种癌症类型中独立鉴定了这些模块，但我们发现在不同肿瘤中获得的模块有显著重叠。

分析构建了16个基因模块，范围从9到297个基因。一些模块在特定的器官系统（如大脑或妇科器官）中富集，而另一些模块则跨越了几个器官系统和组织学。在输卵管、乳房和肝脏正常上皮数据集中测试了模块的过度分散，发现大多数模块存在于正常组织中，但分散度较低，这表明这些模块并不是针对癌症的。

由细胞周期基因（如TOP2A、PCNA）组成的高度重复性模块，和应激反应（如JUN、FOS、HSPA1B），被认为是肿瘤发生的一致特征。空间转录组学数据也支持了癌症细胞中存在这种状态。

干扰素反应模块被广泛检测到，包含干扰素刺激的基因（如STAT1和IFIT1）和抗原呈递的成分（MHCI和MHCII），这是干扰素的一种特征性作用。虽然MHC II的表达通常与专业抗原呈递细胞相关，但该途径也在正常上皮细胞和癌症细胞中表达。

还发现了两个与代谢过程相关的模块：缺氧模块（例如VEGF、ADM）和氧化磷酸化模块（例如ATP5H、LAMTOR2）。金属硫蛋白基因的另一个基因模块（称之为金属反应模块）可能在几种癌症类型的增殖和耐药性中发挥作用。

另一组模块与细胞身份对应，似乎与起源的组织和细胞有关。大多数肿瘤来源于上皮，因此确定了与已知上皮细胞类型标志物重叠的模块：肺泡模块（如AGER、CAV1），特别存在于LUAD中，以及基底细胞（如KRT5和KRT15）、鳞状细胞（如KLK10、LY6D）和腺细胞（如CLU、MUC5B）模块。在子宫内膜样OVCA和UCEC、LUAD和GBM中存在由纤毛相关基因（如FOXJ1、PIFO）组成的模块。正常输卵管和肺上皮组织中存在该模块，表明其在癌症中的差异表达反映了起源组织的异质性。

跨越多种癌症类型的两个模块与上皮-间充质转化（EMT）有关：一个完整的间充质模块（cEMT）（例如COL1A1、FN1）和一个缺乏典型间充质标记物（例如LAMC2、VIM）的部分间充质组件（pEMT），例如胶原基因。

最后，确定了三个与神经肿瘤特异性模块：类星形胶质细胞（AC）（例如APOE、ALDOC）、类少突胶质细胞祖细胞（OPC）（例如OLIG1、OLIG2）和类神经祖细胞（NPC）（如DLX1、DLX5）模块。

2. 通过基因模块表达定义癌症细胞状态

为了了解基因模块是如何在单个细胞水平上组装的，对每个恶性细胞的每个模块的表达进行评分。对19例不同肿瘤细胞模块评分进行降维，癌细胞不按患者或癌症类型分组，而是按其最高表达的模块分组。分析发现某些模块之间的一些共表达：例如pEMT与应激和干扰素反应共表达。

某些模块也存在于非癌症样本中，分析配对样本恶性和非恶性上皮之间表达每个模块的细胞比例是否存在差异。pEMT模块在所有四种癌症类型中的表达频率都较高，与肿瘤进展中常见的EMT一致。干扰素应答模块在LUAD和SKSC中的表达频率增加。相对于正常导管细胞，PDAC中的鳞状模块被诱导，表明恶性细胞群中的鳞状分化。基于转录组学分析已经提出了PDAC的几种分类，包括经典亚型（腺基因的高表达，包括TFF1和CEACAM6）和基础亚型（鳞状和基础基因的高表现，包括LY6D和KRT15）之间的区别。虽然胰腺鳞状细胞癌症很少见，但PDAC中鳞状细胞表达频率的增加表明，向鳞状细胞方向的部分化生是常见的。类似地，相对于正常皮肤，腺模块在LUAD和PDAC中的表达没有变化，但在SKSC中的表达增加。这种模式突出了来源组织表达的模块的保留和其他细胞类型模块的重组。

3. 肿瘤细胞邻域的癌细胞状态分析

利用空间转录组测序（ST）分析癌症细胞状态和TME细胞之间的相互作用。由于这项技术不是单细胞分辨率的，使用配对单细胞数据进行了非线性最小二乘（NNLS）回归，将spot注释为“恶性”(仅包含恶性细胞)，“正常”(仅含免疫和基质细胞)，以及“两者”(都包含)。

每个样本中都存在“正常”和“两者”的点，能够分析存在恶性细胞的情况下，组织的细胞类型组成是如何变化的。分析发现，在同样含有恶性细胞的spot中，内皮细胞的比例较低，这表明肿瘤的血管化不完全。相反，中性粒细胞在“两者”的spot点中的数量更高。肿瘤相关巨噬细胞被广泛定义为M1-抗肿瘤/促炎-和M2-促肿瘤/抗炎。对于每个含有巨噬细胞的斑点，对其M1/M2极性进行评分。在卵巢癌、子宫内膜癌等六个妇科样本中，发现M1/M2中的“两者”点高于“正常”点，这表明癌症细胞附近具有强大的抗肿瘤巨噬细胞活性。

为了研究细胞间通讯关系，分析了每个ST样本中的癌症细胞状态，对每个“恶性”点的模块表达进行了评分。为了表征每个“恶性”spot点周围的细胞类型组成，计算了两个评分指数，以捕捉其微环境。将每个肿瘤的“恶性”spot点的模块得分和细胞类型邻域特征关联起来，可以揭示出TME的癌症细胞状态和细胞类型如何共同定位形成“邻域”。在BRCA NYU2肿瘤中，干扰素反应模块和巨噬细胞成正相关。为了探索所有样本之间的这种关系，计算了巨噬细胞邻域的相关性得分。在所有样本中，与干扰素反应的相关性均为阳性，10个样本中有8个样本具有显著性。

4. TME对干扰素反应的调节

癌细胞和DC细胞分泌干扰素α和干扰素β，导致T细胞启动和抗肿瘤活性。为了进一步测试干扰素反应与TME中T细胞之间的关系，建立了同种异体小鼠癌症模型，在该模型中TME很容易受到干扰。在四个原位胰腺肿瘤上进行了scRNA-Seq，以验证基因模块可以在原位模型中重现。与之前一样，使用NMF识别基因模块，发现有五个重复的基因模块：循环、应激反应、干扰素反应、缺氧和腺分化。

此外，还收集了在Rag1−/-小鼠中形成的四个原位肿瘤的scRNA-Seq数据，分析肿瘤恶性细胞中的基因模块表达，发现在Rag1−/-和WT小鼠之间，循环、应激反应、缺氧和腺分化的表达相似。相反，干扰素反应模块在Rag1−/−小鼠的肿瘤中表达较低。干扰素应答模块的MHC I基因（B2m、H2-D1、H2-K1）在Rag1−/-小鼠中的总体表达较低（尽管它们在表达干扰素应答的细胞中保持相对上调），这表明淋巴细胞耗竭对MHC I的表达有额外的影响，与干扰素应答无关的。干扰素应答细胞的频率也因肿瘤位置而异。

参考文献：

Barkley Dalia,Moncada Reuben,Pour Maayan et al. Cancer cell states recur across tumor types and form specific interactions with the tumor microenvironment.[J] .Nat Genet, 2022, 54: 1192-1201.