「青莲聚焦」酒精相关肝病的非侵入性蛋白标志物

Noninvasive proteomic biomarkers for alcohol-related liver disease

研究对象：酒精相关肝病（ALD）临床病人、健康人

发表期刊：nature medicine

发表时间：2022.06

影响因子：87.241/Q1

技术策略：DIA蛋白质组学、机器学习模型

发表单位：马克斯·普朗克生物化学研究所

DOI：10.1038/s41591-022-01850-y

研究背景

酒精相关肝病（ALD）是常见的慢性肝病，经常导致肝硬化。随着发病率上升，已成为肝移植的主要适应症。脂肪变性、酒精性肝脏炎症和纤维化是明显的组织病理学特征，标志着ALD向肝硬化的发展，然而这种发展往往是无症状和非特异性的，ALD患者在发生肝硬化后才被诊断，导致错过了最佳治疗阶段，这使得早期诊断极具挑战性。现有的非侵入性生物标志物在疾病早期诊断的准确性有限。因此，迫切需要微创诊断策略来筛查高危人群中的患者。

本篇文章通过在现有大规模临床试验发现DIA血浆蛋白质组学生物标志物组合检测肝损伤，并探索其作为肝病临床诊断和预后工具的潜力，揭示关于ALD病理生理并为新的治疗方案提供见解。

样本策略

1、ALD患者筛选队列（GALA–ALD，n=459例血液，其中79例为组织-血浆配对患者）；

2、健康对照队列（GALA–HP，n=137例血液）；

3、ALD筛查验证队列（GALA–ALD，n=63例血液）

技术流程

文章通过数据非依赖性采集质谱技术（DIA-MS）对GALA-ALD队列中459例ALD患者的血浆样本和79份肝组织分别进行蛋白质组学分析，并结合血浆蛋白质组学数据和机器学习，构建了用于检测早期纤维化（F2）、炎症（I2）和脂肪变性（S0）的预测模型。最后在独立的验证队列得到了证实。

结果速递

肝脏病变对肝脏和血浆蛋白组的影响

基于DIA-MS的肝脏蛋白质组学总共鉴定出5515个蛋白质，发现717种与三种疾病脂肪变性、纤维化、脂肪肝炎相关的差异蛋白，其中68种在脂肪变性阶段显著失调，135种和658种分别在炎症活动阶段和纤维化阶段显著失调（FDR<0.05），纤维化对肝脏蛋白质组的影响最大，其次是炎症，84%炎症失调的蛋白也在纤维化过程失调。作者根据人类蛋白质图谱中的注释对失调蛋白进行分组，发现随着肝纤维化进展的增加“肝脏特异性”蛋白有87%出现下调，80%注释为“分泌”的蛋白质被上调，这也与作者以往关于非酒精性脂肪肝（NAFLD）和肝硬化的研究报道相似。

通过相关性分析发现，在三类排名前20 的相关蛋白中，与纤维化阶段最相关的主要是肝脏的分泌蛋白。与炎症相关的蛋白中有50%是细胞骨架蛋白，表明肝脏炎症会导致细胞结构发生变化。与脂肪变性相关的蛋白中，PLIN2和FABP4以往被认为是NAFLD患者NAFLD47患者从单纯脂肪变性变向非酒精性脂肪肝炎的预测标志物。

血浆蛋白质组检测发现225种蛋白质在纤维化的组织学阶段（206种蛋白质）、炎症活性（163种蛋白质）和脂肪变性（48种蛋白质）中有显著差异，其中，随着纤维化阶段的增加，134种蛋白质表达上调，91种蛋白质表达下调。在这些被注释为“肝脏特异性”或“分泌”的失调蛋白质中，分别有83%和64%被发现下调。ALD患者Reactome通路分析表明血浆含量下调的蛋白包括补体系统、凝血因子、载脂蛋白和载体蛋白等。相关性分析发现，分别有106/55/5种蛋白与纤维化/炎症活动/脂肪变性相关，其中补体成分C7、QSOX1和LGALS3BP与纤维化程度相关性最高，具有纤维化和炎症标志物潜力，同时，与ALD脂肪变性相关性排第二的ALDOB也是NAFLD的潜在生物标志物。

肝脏与血浆蛋白质组学数据整合

研究人员对肝脏和血浆中共同测定的420种蛋白质进行了整合分析，结果显示在二维空间呈现两簇。“对角簇”表明这组蛋白质的相对丰度在肝脏与血浆中很大程度是相关的，而“垂直簇”蛋白组则表明其在肝脏和血浆中的相对丰度相关性较弱。有112种蛋白的相对丰度在成对的肝脏和血浆样本中显著相关，例如其中C7和IgA1的r值高达0.85，作为心血管疾病的系统性风险标志物的CRP在肝组织和循环中的水平高度相关（r = 0.73）。共有46个蛋白在肝脏和血浆蛋白组中均存在显著差异，主要参与免疫和炎症反应、细胞粘附、ECM组织、蛋白酶抑制剂和细胞内酶。大多数蛋白随着纤维化进展（F0-F4）在血浆和组织中逐渐上调，少数蛋白在组织和血浆中表达不一致，推测可能是因为血浆水平是反映组织渗漏和肝脏合成受损的综合结果。

ALD 早期病理学的生物标志物

在标志物的筛选方面，研究人员首先比较了22种最先进的机器学习分类器并确定了逻辑回归模型作为最终分类器，作者选定了三组标志物分别用于表征区分显著肝纤维化（9种蛋白质）、轻度炎症活动（6种蛋白质）和肝脂肪变性（12种蛋白质）。在包含三组标志物的22个蛋白中，有8种在血浆和肝脏中受到协同调节，包括 C7、LGALS3BP、TGFBI、ALDOB、CLEC3B、FBLN1、ATRN 和 SERPINF1。逻辑回归模型的平均交叉验证结果显示，三组蛋白标志物组合模型对于显著纤维化、轻度炎症活性和任何脂肪变性的平均ROC-AUC分别为0.90、0.85和0.91，具有良好的诊断效能。与15种最先进的临床测试模型相比，蛋白质组学模型具有最高的F1分数和平衡准确性。

独立队列验证模型性能和预后性能

健康对照组中，使用蛋白组学数据构建的模型能够正确地排除队列中的显著纤维化（≥F2）、晚期纤维化（≥ F3）和轻度炎症（≥ I2）准确率分别是99%、100%和98%，其中15%的健康个体被归类为脂肪变性阳性，是由于他们的BMI指数与GALA–ALD队列相一致。对于有酒精滥用史且因肝硬度低而未进行活检的患者集（n = 97），该模型排除显著和晚期纤维化的准确率分别是93%和100%。

接下来，作者使用了独立ALD验证队列（n = 63）验证模型性能，模型产生的ROC–AUC分别为0.87和0.81，显著纤维化和轻度炎症的模型效能高于其他同类模型。

最后作者对GALA–ALD队列中457名患者从纳入之日起至死亡或随访期结束（53个月）的纵向临床数据进行采集并定义了肝脏相关事件和全因死亡率事件，将蛋白质组学模型与其他商业生物标志物和肝纤维化的组织学分期进行比较，此模型对患者肝脏相关事件具有最高的判别准确率（Harrell'sC  = 0.900 ，3年和5年AUC分别是 0.945和0.933）；对于全因死亡率，蛋白组学模型的表现最好（Harrell's C  = 0.789、3 年和 5 年 AUC 分别是 0.836 和 0.818）。综上所述，这项研究构建的蛋白质组学模型是准确的预后指标。

作者利用ALD患者，健康对照和ALD独立验证队列的肝脏和血液DIA蛋白组学研究，发现肝脏生理病例相关的肝脏和血浆均发生显著的蛋白质组重塑现象。首次利用基于质谱的蛋白组学和机器学习模型确定三组蛋白生物标志物组合准确检测ALD中的纤维化、炎症和脂肪变性三种疾病，并在独立测试集中得到了验证。最后结合随访数据进一步证明了模型对于肝脏相关事件和全因死亡率的预后性能高，为临床诊断和精准医疗提供可靠依据。