汕头大学医学院附属肿瘤医院马长春团队：4张图拿下7分+，CAR细胞治疗打赢肿瘤免

肿瘤免疫作为国自然热点，近两年发了这么多生信文章，不想再啃老套路了，还能从哪个角度突围呢？

免疫细胞疗法！

CAR-T细胞或CAR-NK细胞在肿瘤中的研究是非常火热的，我们就从临床高需求问题入手去打这场肿瘤免疫突围战！下面小云就用文章实例展示下具体操作~ 文章由汕头大学医学院附属肿瘤医院的马长春教授团队发表，首先

从肿瘤临床迫在眉睫的问题入手

（食管癌中适用于基于CAR治疗的肿瘤表面抗原的数量有限），研究肿瘤表面抗原CD22作为CAR-NK细胞治疗的潜在靶点的可行性。

选题上瞄准“CAR-NK细胞”大热点，目前这个方向在生信领域的发文比较少，发文空间还是非常大滴，所以创新性和临床意义都拉满了；再者利用生信分析与实验相结合的方法串联起来一个完美的证据链，仅用4张图就发到了7分+的文章上，效果非常赞！

学会这个思路，换个癌种还能复制，关注肿瘤免疫方向的小伙伴行动起来~

题目：CD22是CAR-NK细胞治疗食管鳞状细胞癌的潜在靶点

杂志：J Transl Med.

影响因子：IF=7.4

发表时间：2023年10月

研究背景

嵌合抗原受体NK (CAR-NK)细胞疗法是最有前途的免疫疗法之一。虽然它在血液恶性肿瘤中显示出显著的治疗效果，但在包括食管鳞状细胞癌(ESCC)在内的实体瘤中很少获得成功，主要原因是缺乏特异性细胞表面抗原和复杂的肿瘤微环境。研究发现CD22，一种众所周知的血液恶性肿瘤的肿瘤表面标记物，在ESCC表达，可能作为CAR-NK细胞治疗的潜在靶点。

研究流程

作者首先收集了临床使用的13种肿瘤细胞表面抗原，在TCGA队列中分析其表达，然后在2个ESCC细胞系和自有队列的2个患者样品中通过qPCR检测以上13个基因的表达，将3个来源的差异基因取交集后，选择CD22作为目标基因。随后，分别用免疫荧光法(IF)和免疫组织化学法(IHC)检测了87例ESCC样本中CD22的表达，并计算H-score。此外，作者在TCGA队列和自有队列中利用KM曲线分析CD22表达与OS预后的相关性。最后，通过实时细胞分析仪(RTCA)平台研究CD22靶向的CAR-NK细胞对ESCC细胞系的抗肿瘤活性。  

主要结果

1. 通过联合筛选策略识别CD22作为潜在靶标

基于当前在临床试验中的使用，作者选择了十三个靶标（CD19、CD20、CD22、CD33、CD38、CD44、ROR1、PSCA、FAP、GPC3、EGFR、MET、MUC1和MUC16），首先在TCGA-ESCC队列中分析其表达（图1A），然后在2个自有队列患者的癌和癌旁组织（图1B）以及2个在2个ESCC细胞系(KYSE140，KYSE150)中通过qPCR检测以上13个基因的表达（图1C）。将3个来源的差异表达基因取交集，获得2个共享基因（CD44和CD22），由于研究人员已经报道CD44在ESCC的肿瘤起始细胞中高表达，所以本研究选择CD22作为潜在靶标进行后续研究。作者随后通过免疫荧光检测再次验证KYSE140和KYSE150细胞中CD22的表达，结果显示可以在细胞膜和细胞质中发现CD22（图1E）。

图1 CD22的筛选和表达验证

2. CD22在ESCC患者组织标本中的表达验证

作者通过IHC分析了自有队列中87例ESCC患者的CD22表达，由于CD22被广泛认为是B细胞的标志，所以本研究用PBS孵育的扁桃体癌切片用作阴性对照（图2A），使用富含B细胞的扁桃体癌作为阳性对照，染色结果显示CD22在扁桃体癌淋巴结中强表达（图2B）。对ESCC患者的染色结果显示，肿瘤细胞膜中的CD22表达明显（图2C），在第二个患者中CD22主要在肿瘤细胞的细胞质中表达(图2D)，而在某些情况下，在基质中也发现CD22阳性淋巴细胞(图2E)。随后根据IHC结果对87名ESCC患者的组织切片进行了H评分，0分表示在肿瘤细胞中表达阴性或很少(图2F)，1分代表弱阳性表达(图2G)，2代表中度阳性(图2H)，3代表高度阳性表达(图2I)。

图2 CD22在ESCC患者组织标本中的表达验证

3. CD22表达与总生存率的相关性分析

作者基于TCGA-ESCC队列，利用KM曲线分析CD22的表达与OS的相关性，显示CD22表达与TCGA患者的总生存率无关（图3A）。同时也在自有队列的87名ESCC患者中进行KM生存分析，以H评分代表CD22表达评估其与OS的相关性，结果显示，CD22阳性患者的OS与CD22阴性患者的OS无显著差异（图3B）。

图3 CD22表达与OS的相关性分析

4. CD22靶向CAR-NK细胞的体外抗肿瘤活性研究

作者首先利用流式细胞仪进一步分析了KYSE140和KYSE150细胞中CD22的表达，证实了CD22的膜表达（图4A）。作者先从iPS细胞中诱导NK细胞产生，并验证它们对K562细胞系的杀伤能力，结果显示，iPS-NK细胞的杀伤率随着iPS-NK细胞数量的增加而增加（图4B）。随后作者构建了CD22-CAR，并将其转导到iPS细胞中，然后诱导CD22-CAR-iPS细胞分化为CD22-CAR-NK细胞。流式细胞仪显示CD22的单链可变片段在CD22-CAR-NK细胞中高度表达，但在iPS-NK细胞中不表达(图4C,D)。同时，CD22-CAR-NK细胞也表达NK细胞标记物(图4E)。最后，将工程化的CD22-CAR-NK细胞分别与两种ESCC细胞系共培养，通过xCELLigence系统观察杀伤作用。结果显示，与iPS-NK细胞相比，CD22-CAR-NK细胞显示出更高的细胞毒性（图4F,G）。

图4 CD22靶向CAR-NK细胞的体外抗肿瘤活性研究

文章小结

看完这篇文章思路有没有觉得肿瘤免疫方向的研究还有很多可做之处？文章从临床高需求问题入手，选择明星热点“CAR-NK细胞疗法”，选题创新性满满，并且相当贴近临床更容易获得审稿人的青睐，同时利用生信+实验相结合的方法，既可以省一定的时间和经费，又可以丰富文章，加强靶点选择的证据性，所以直接4张图拿下了7分+的文章，效果不得不说很赞啊！想在肿瘤免疫方向做点新东西的小伙伴，不要错过这个好思路，可以换个癌种复现，还可以拓展做国自然课题，一举两得~