USP9X去泛素化ALDH1A3并维持胶质母细胞瘤干细胞的间充质特性
写在前面
今天推荐的是由南京医科大学第一附属医院在2019年4月8日发表于The Journal of Clinical Investigation(2020IF:14.808,JCR 1区)的一篇文章,通讯作者是Huibo Wang教授,研究表明USP9X 去泛素化ALDH1A3并维持胶质母细胞瘤干细胞的间充质特性。
研究背景
胶质母细胞瘤 (GBM) 干细胞 (GSC) 的间充质 (MES) 亚型代表了癌细胞亚群,这些亚群因其高度侵袭性和对常规治疗的抵抗力而臭名昭著。醛脱氢酶 1A3 (ALDH1A3) 最近被认为是维持GSC的MES特征的关键决定因素。然而,支持异常ALDH1A3表达的机制仍然难以捉摸。
摘要部分
作者将泛素特异性蛋白酶9X (USP9X)鉴定为MES GSC中ALDH1A3的去泛素化酶。USP9X与ALDH1A3相互作用、去多聚泛素化并使其稳定。此外,作者发现FACS分选的USP9Xhi细胞富含具有高ALDH1A3活性和强致瘤能力的MES GSC。USP9X 的消除显着下调ALDH1A3,导致MES GSC的自我更新和致瘤能力丧失,这在很大程度上可以通过ALDH1A3的异位表达来挽救。此外,作者证明USP9X抑制剂WP1130诱导ALDH1A3降解,并在MES GSC衍生的原位异种移植模型中显示出显着的治疗效果。此外,USP9X与原代人类 GBM 样本中的ALDH1A3表达密切相关,并且对MES亚组患者具有预后价值。总的来说,作者的发现揭示了USP9X作为ALDH1A3蛋白稳定的关键去泛素化酶和GSC导向治疗的潜在靶点。
研究内容
1.USP9X保持ALDH1A3的稳定性
作者使用针对HEK293T细胞中98个DUB的siGENOME RTF库进行了RNAi筛选。该初始筛选确定了与ALDH1A3表达相关的4个DUB。作者发现只有USP9X与ALDH1A3在293T共表达能够直接与内源性ALDH1A3相互作用。作者随后将带有Flag标签的WT USP9X或催化失活的突变体 C1566A USP9X转染到HEK293T 细胞中。只有WTUSP9X的表达以剂量依赖性方式增加ALDH1A3蛋白水平,表明USP9X以依赖于其 DUB 活性的方式调节 ALDH1A3。USP9X 的过表达或敲低均未改变ALDH1A3mRNA水平。
作者研究了USP9X是否会影响不同GSC亚型中的ALDH1A3表达水平。为此,作者从患者的 GBM 细胞中分离出2个MES GSC和 2 个原神经GSC作为皮下异种移植物。作者观察到 MES GSC表现出高水平的USP9X和 CD44 表达。
接下来,作者使用慢病毒shRNA敲低细胞中的USP9X。作者注意到 USP9X敲低显着降低了ALDH1A3蛋白的表达,这可以通过添加蛋白酶体抑制剂 MG132 或shRNA抗性WT的过度表达逆转。相反,当USP9X在细胞中异位表达时,ALDH1A3的表达显着增加。USP9X敲低或过表达对ALDH1A3 mRNA水平没有显着影响。为了证明USP9X可以影响 ALDH1A3本身的稳定性,作者使用CHX停止蛋白质合成并检测USP9X操作后的ALDH1A3蛋白质水平。WTUSP9X的过表达导致HEK293T细胞中异位表达的ALDH1A3蛋白的稳定性显着增加,而在 MES 21和505 GSC中敲低USP9X表达导致ALDH1A3蛋白不稳定。

研究结论:USP9X特异性调节ALDH1A3稳定性。
2.USP9X与ALDH1A3相互作用
作者接下来试图确定USP9X是否直接与ALDH1A3相互作用。Co-IP分析表明,在HEK293T细胞和NHA中的Flag-USP9X WT或Flag-USP9X C1566A免疫沉淀物中可以很容易地检测到 ALDH1A3,表明这种相互作用不需要DUB活性。同样,内源性USP9X和ALDH1A3蛋白之间的物理关联在MES 21和505 GSC中得到验证。
此外,纯化的USP9X WT或其C1566A突变体能够与GST-ALDH1A3结合,但不能单独与GST结合,从而证实USP9X和ALDH1A3之间的相互作用是直接的。截断突变分析表明,USP9X的N端序列(氨基酸 1-600)和ALDH1A3的N端序列(氨基酸 1-200)都是相互直接相互作用所必需的。

研究结论:USP9X与ALDH1A3相互作用。
3.USP9X去泛素化ALDH1A3
通过IP用 MG132 处理的细胞ALDH1A3,作者观察到ALDH1A3被大量泛素化。然而,WT USP9X 的共表达几乎完全消除了ALDH1A3泛素化,而C1566A突变体USP9X没有这种效果。相反,对USP9X的下调显着增加了MES 21和505 GSC中的ALDH1A3多泛素化。为了证明ALDH1A3是USP9X的直接去泛素化底物,作者将多泛素化ALDH1A3与纯化的GST-USP9X WT或GST-USP9X C1566A一起孵育。作者发现仅有纯化的 GST-USP9X WT,能够与ALDH1A3相互作用,表明USP9X通过直接去除其泛素化来稳定ALDH1A3。作者还发现USP9X有效地分解了ALDH1A3的Lys48连接的多泛素化,但对ALDH1A3的非降解性Lys63连接的多泛素化没有显着影响。

研究结论:USP9X是一种靶向ALDH1A3蛋白进行去泛素化的DUB。
4.USP9X的高表达预示着ALDH1A3hi MES GSCs的富集具有较强的致瘤能力
作者将 MES 21 和 505 GSC分成表达高 (USP9Xhi) 或低 (USP9Xlo)USP9X水平的亚群。正如预期的那样,与USP9Xlo亚群相比,ALDH1A3在USP9Xhi 亚群中高度表达。此外,ALDEFLUOR测定的结果显示USP9Xhi亚群表现出比 USP9Xlo亚群显着更高的ALDH1活性。
接下来,作者使用稳定表达萤火虫荧光素酶的USP9Xhi和USP9Xlo细胞进行了颅内植入。体内生物发光成像表明,只要500 USP9Xhi细胞就足以在60天内建立肿瘤。形成鲜明对比的是,肿瘤起始至少需要50000 USP9Xlo细胞。免疫组织化学分析表明,携带USP9Xhi细胞衍生肿瘤的小鼠表现出高水平的 ALDH1A3,而携带 USP9Xlo 细胞衍生肿瘤的小鼠对该分子呈阴性或仅微弱阳性。

研究结论:USP9X的高表达可能意味着具有强大致瘤能力的ALDH1A3hi MES GSC的大量富集。
5.USP9X表达的降低会损害MES GSC的自我更新、致瘤性和放射/化学抗性
作者接下来研究MES GSC的自我更新和致瘤性是否需要USP9X。研究发现USP9X 的沉默大大减弱了细胞生长并减少了DNA复制。此外,敲低USP9X表达显着降低了 MES21和505 GSC的肿瘤球形成频率。在USP9X敲低的MES GSC中观察到ALDH1A3和CD44以及主要MES特异性标志物的表达降低。作者接下来检查了USP9X敲低对体内MES GSC致瘤潜力的影响。将shRNA(shCtrl) 或 shUSP9X 转导的荧光素酶标记的MES GSC 21或505颅内注射到小鼠中。与植入shCtrl转导的小鼠相比,植入shUSP9X转导的小鼠显示出更长的生存期,肿瘤形成率较低。
作者发现ALDH1A3可以在很大程度上回补USP9X敲低对细胞增殖、自我更新和致瘤潜力的抑制作用。这些结果表明USP9X/ALDH1A3轴在维持GSC的MES特征中的重要功能。
作者用空的或USP9X慢病毒载体转导PN 35和182 GSC(两种细胞株USP9X表达量低),并用电离辐射或替莫唑胺处理稳定转导的细胞。发现在PN GSCs中USP9X的强制表达赋予了对IR和TMZ的抗性,而USP9X的敲低增强了PN GSCs对IR和TMZ的敏感性。这些结果表明USP9X可能有助于获得PN GSC中的放射/化学抗性。

研究结论:USP9X的表达降低会损害MES GSC的自我更新、致瘤性和放射/化学抗性。
6.USP9X 的药理学抑制减弱了具有高ALDH1A3活性的 MES GSC 的肿瘤启动能力
作者随后研究了USP9X药理抑制对MES GSC衍生的GBM模型的影响。作者使用了USP9X小分子抑制剂 WP1130。研究发现1 μmol/lWP1130几乎完全消除了USP9X从多泛素化ALDH1A3中去除泛素部分的能力。相应地,WP1130 处理降低了MES 21和505 GSC中的ALDH1A3蛋白水平,而不影响其mRNA水平。此外,WP1130 显着抑制MES 21和505 GSC中的ALDH1 活性。
接下来,作者检查了MES 21 和 505 GSC对WP1130的敏感性。作者发现用WP1130处理MES GSC 导致细胞增殖和肿瘤球形成能力的显着抑制,伴随着 MES 特征的消失。然后,作者评估了WP1130对患有源自MES 21和505 GSC的颅内肿瘤的小鼠的治疗效果。与作者的体外研究结果一致,通过7天连续CED输注WP1130,接受WP1130治疗的荷瘤小鼠与载体治疗的小鼠相比显示出肿瘤生长减慢和存活率提高。免疫组织化学分析所示在这些肿瘤中,USP9X、ALDH1A3和CD44的表达水平被WP1130强烈减弱。

研究结论:USP9X的药理学抑制可能通过促进ALDH1A3不稳定来有效消除MES GSC。
7.USP9X 与ALDH1A3蛋白水平呈正相关,并且与 ALDH1A3hi MES GBM 的存活率低有关
最后,作者对组织微阵列中的USP9X、ALDH1A3(MES GBM 标记)和OLIG2(PN GBM 标记)进行了免疫组织化学染色。USP9X与ALDH1A3表达密切相关,与OLIG2相互排斥。此外,Kaplan-Meier 生存分析表明USP9X表达水平对OLIG2hi GBM 患者的患者生存没有预测价值。相比之下,USP9Xhi GBM 患者在 ALDH1A3hi 患者组中的总生存期和无进展生存期显着缩短,表明USP9X对 MES 亚组内的患者具有预后价值。

研究结论:人类GBM数据与作者在GSC中USP9X介导的ALDH1A3稳定和相关MES特征的实验结果强烈一致。
结论与讨论
在这项研究中,作者证明USP9X可调节ALDH1A3多泛素化和稳定性。作者发现USP9X是预测ALDH1A3hi MES GSC富集的关键分子,并且是MES GSC自我更新和致瘤性所必需的。作者还评估了USP9X抑制对患者来源的MES GSC异种移植模型的潜在治疗效果。总之,该研究将USP9X鉴定为稳定ALDH1A3并保持其高活性的关键去泛素化酶,USP9X的去泛素化作用可以维持GSC的MES特性、自我更新和致瘤能力。因此,通过USP9X的药理学抑制来稳定ALDH1A3可能为GBM的治疗干预开辟一条途径。
Thank you!
原文链接:https://www.jci.org/articles/view/126414