如何设计siRNA

为了确保干扰序列的有效性，大家会优先从文献中查找已验证过的siRNA，但研究的基因千千万，不是每个基因都恰好有经实验验证的干扰序列，遇到这种情况，免不了需要自己设计siRNA。今天小编就和大家讲讲siRNA设计原则和方法，希望能帮到正在研究基因干扰的小伙伴~

 

siRNA设计原则

（1）siRNA序列在靶基因中的位置

一般从靶基因起始密码子AUG下游50~100个核苷酸开始搜寻理想的siRNA序列，越靠近靶基因的3′端，其基因沉默效果可能越好。

（2）siRNA序列的起始碱基与长度

siRNA序列最好为AA（N n）UU（N 代表任意碱基，n为碱基数目）， NA（N n） UU和NA（N n）NN序列也可以。19-29个核苷酸的siRNA序列通常是最有效的，长于30个核苷酸可导致非特异性沉默。

（3）siRNA 3’端突出碱基的选择

通常情况下，siRNA与3’端为dUdU或者dTdT的游离碱基的mRNA结合效率更高。建议用dTdT取代3′端的2 个碱基突出，增强siRNA 双链复合体的稳定性。

（4）siRNA序列中的G/C含量

G/C含量在35%~55%的siRNA序列，其沉默基因效果较好。

（5）siRNA 中应避免连续的单一碱基和反向重复序列

连续2个以上的G和C可能会降低双链RNA 的内在稳定性，从而抑制RNAi作用；连续3个以上的U和A可能终止由RNA Polymerase III介导的转录。siRNA序列中的重复序列或回文结构可能形成发夹状结构，这种结构的存在会降低siRNA的有效浓度和沉默效率。

（6）siRNA双链的内在稳定性

siRNA正义链的5’端第一个碱基尽量为G或C；反义链5’端的第一个碱基尽量为A或U。

（7）siRNA正义链的碱基偏爱性

正义链的第一位和第十九位碱基为A；正义链的第十位碱基为U；正义链的第十三位碱基不为G；正义链的第十九位碱基不为G或C时，siRNA 序列具有较高的基因沉默效率。

（8）siRNA 序列的特异性

目前没有发现siRNA的干扰效率与mRNA中具体位置的关系，为确保对靶mRNA的有效抑制，针对每一个靶基因结合上述siRNA设计原则选择靶点相差25bp以上的4星半以上的至少3条序列。

 

siRNA设计常用程序

以上是常用的三个siRNA在线设计程序，小伙伴可直接将下方网址复制到浏览器中查看哦

http://sidirect2.rnai.jp/

https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/

https://www.invivogen.com/sirnawizard/

 

siRNA设计步骤

以人siglec15基因为例，首先通过NCBI找到该基因有一个转录本 NM_213602.3，将NM号或者CDS序列复制到网站（https://rnaidesigner.thermofisher.com/rnaiexpress/）中。

 

点击RNAi Design，导出设计结果

注：若靶基因有多个转录本，则需要把所有NM号对应的CDS序列进行比对，得到共有序列CCDS，针对CCDS进行设计。

目前没有发现siRNA的干扰效率与mRNA中具体位置的关系，为确保对靶mRNA的有效抑制，针对每一个靶基因结合上述siRNA设计原则选择靶点相差25bp以上的4星半以上的至少3条序列。随后将siRNA片段进行Blast分析，尽量选择与靶基因特异结合的序列，进行化学合成后，通过体外实验筛选出沉默效率最高的siRNA 序列进行下一步的基因功能研究。

PS：有的siRNA序列在设计时没有遵守这些指导方针，但经实验证明也具有很高的干扰效应，这表明，我们只能根据上述指导方针设计出理论上具有较高沉默效应的siRNA序列，siRNA的最终活性需要用实验来验证 。

以上就是本期内容了，若对siRNA设计存在疑问，欢迎咨询汉恒生物！