「青莲聚焦」单细胞蛋白质组电喷雾电离质谱技术发展趋势

单细胞蛋白质组学的研究是精确理解生物体的生长和发育以及疾病的发生和发展所必需的。然而，单细胞蛋白质组学的研究仍处于起步阶段，部分原因是单细胞中的蛋白质种类多、丰度低、数量少、不可扩增性。基于质谱（MS）的单细胞蛋白质组学在过去二十年中发展迅速，其特点包括样品要求量低、灵敏度高、结构信息丰富以及不需要使用抗体进行标记。电喷雾电离质谱（ESI-MS）为单细胞蛋白质组学提供了最高的蛋白质覆盖率。然而，由于各种预处理方法、分离技术和MS仪器的可用性，单细胞蛋白质组学技术的样品通量和覆盖范围可能有很大差异。

北京工业大学的汪夏燕教授团队根据用于分离单细胞蛋白质样品的不同方法对相关出版物进行了分类，介绍了检测覆盖率和通量方面的不同方法，并强调了提供重大突破和进步的技术；阐述了基于ESI-MS的单细胞蛋白质组学的应用和发展前景。

发表期刊：Trends in Analytical Chemistry

IF 14.908

发表时间：2022-12-31

发展历程

传统的群体细胞蛋白质组学分析方法需要较大的样本体积，通常为毫升（mL）量级。然而，大多数动物细胞的直径为5-30um，单细胞体积为皮升（pL，10-12L）水平，为了便于MS检测单细胞中的蛋白质，近年来基于ESI-MS的单细胞蛋白质组学分析方法专注于减少样品的处理量。

1：单细胞蛋白的初步检测

Zhang等人在2015年提出了一种集成蛋白分析设备（iPAD），可以应用于100个细胞的蛋白质组分析（IPAD-100），乃至单细胞蛋白质分析（IPAD-1），单个HeLa细胞鉴定的蛋白质总数为328，检测限约为1.7-170zmol。

Fang等人提出了毫升级油气滴（OAD）芯片，该方法样品损失最小，样品注入效率高（>99%），将该系统应用于单个HeLa细胞，鉴定出51种蛋白质；还使用该系统分析了单小鼠卵母细胞，并鉴定了355种蛋白质。与传统的管内系统相比，该方法具有序列覆盖率高、疏水蛋白和酶消化效率高的优点。

Zhu和Kelly等人描述了一种基于纳米微滴的处理平台（nanoPOTS）（图1），通过该设备捕获芯片上的纳米微滴中单个细胞并进行裂解和蛋白消化。使用nanoLC-MS方法从单个CTC（LNCaP）细胞中总共检测到167种蛋白质。随后，结合荧光激活细胞分选（FACS）用于将单个细胞沉积到纳米液滴样品处理芯片中，配适超灵敏纳米LC-MS进行分析，从单个HeLa细胞中鉴定出约670种蛋白质（平均）。此外，来自酶解离的人肺原代细胞的细胞类型可以被区分，并且通过该单细胞蛋白质组学平台鉴定了间充质细胞和上皮细胞的特异性蛋白质标记物。

通过最小化样品预处理体积，开发了一种减少单细胞蛋白质样品吸附的方法，以进一步减少样品的损失。Shi等开发了一种表面活性剂辅助的样品制备方案（图2）：SOP-MS方法将MS兼容的n-十二烷基-β-D麦芽糖苷与疏水表面基质离心管或多孔板结合，用于样品制备。该方法消除了所有样品转移步骤，并使有效单细胞处理的表面吸附损失最小化，从而提高了检测灵敏度。实现了来自小组织切片（接近20个细胞）的1200个蛋白质的无标记定量；将该方法应用于单细胞分辨率患者的CTC衍生异种移植物（PCDX）模型中，揭示了早期转移肺细胞和原代肿瘤细胞中不同的蛋白质特征。

为了减少样品吸附和损失，缩短处理时间，Kitamori等报告了一种集成的纳米流体芯片装置，用于在毫微微升（fL-pL）范围内操纵样品以进行高通量分析（图3）。该装置适用于胰蛋白酶水解、色谱分离和无标记检测，本研究使用了紫外检测，预计ESI-MS与该装置结合将在未来用于单细胞蛋白质组学分析。

2：提高单细胞蛋白质组学检测的覆盖率

进一步提高单细胞蛋白质组学的覆盖，同时能够量化蛋白质，进行了三个方面的研究，即(1)放大的蛋白质信号；(2)增强分析柱的分离性能；(3)使用高灵敏度的MS。

Slavov等提出了单细胞SCoPE-MS方法，将来自单个细胞的TMT标记载体蛋白与来自200个细胞的TMT-标记载体蛋白混合来实现信号放大。该方法结果显示了不同人类癌症细胞类型的异质性，并量化分化小鼠胚胎干细胞中的1000多个蛋白质。于2021发布了SCoPE2（图4），该方法改进了样品制备、数据采集和分析、不同TMT批次的整合，增加了分析的蛋白质数量，提高了准确性和通量。在10天内对1490个单核细胞和巨噬细胞中的3042个以上的蛋白质进行了定量，定量的蛋白质可用于按细胞类型识别单个细胞。

近年来，随着单细胞蛋白质信号放大策略的发展，色谱柱的分离性能和MS灵敏度得到了改善和提高。直径几十微米的填充色谱柱逐渐发展为直径几百纳米至几微米的开管色谱柱，称为picoLC；Zhu和Kelly等在预处理过程中采用了高场非对称离子迁移光谱法（FAIMS），配适超灵敏MS进行单细胞蛋白质组学分析（图5）。在无标记条件下，单个细胞中鉴定出1000多种蛋白质；Zhu和Kelly等人还将TMT信号放大策略与超灵敏纳米LC-MS技术相结合，以量化单个细胞中的约1500个蛋白质。Liu等人提出了一种结合皮升级液相色谱和质谱（picoLC MS）的方法。picoLC柱的内径为2um，从仅75pg的胰蛋白酶肽中鉴定出约1000种蛋白质，与当前先进的LC或CE-MS方法相比，灵敏度提高了10-100倍，这种超窄内径毛细管柱具有样品消耗小和分离效率高的特点。因此，picoLC MS有望成为单细胞蛋白质组学的有力工具。

3：提高单细胞蛋白质组学检测的通量

2008年，Audet等人提出了一种利用超声剪切细胞并在细胞表面产生局部高压超快裂解单细胞的方法，该技术平均需要50秒才能裂解单个细胞；当细胞在超声处理前用弱洗涤剂（如洋地黄苷）处理时，细胞裂解时间可缩短至3秒。Kitamori等人开发的集成纳米流体芯片装置发现，在纳米通道中，12小时的大量消化色谱图与15分钟的消化色谱图相似，表明两种条件达到了相似的消化状态。

Zhu和Kelly等人将微流体芯片平台、单细胞自动分选和自动样品注射结合到单细胞预处理过程中（图6）以加快单细胞蛋白预处理速度。每个芯片允许快速分析243个单细胞。

单细胞蛋白质组学测量的灵敏度随着低流量分离（<100nL/min）而提高，但样品加载、柱清洁和再生所需的时间导致低通量和MS的低效利用，Kelly等人开发了双柱液相色谱（LC）系统（图7），该系统使用两个并行子系统进行样品加载、在线脱盐、分析和柱再生，从而大大提高了无标记单细胞蛋白质组的产量。作为两个柱交替处理的结果，高通量LC系统可重复使用。在单个HeLa细胞的分析中，当周期为30min时，每个细胞中可鉴定出近1000个蛋白质，当周期时间为15min时，每细胞可鉴定出660个蛋白质。

4：其他分离手段-毛细管电泳

单细胞蛋白质样品也可以通过毛细管电泳（CE）分离。CE中通常使用两种样本采集方法，一种是从组织中分离单个细胞；另一种是使用移液管从单细胞微区吸取样本。Sweedler等人建立了CE-TIMS MS方法，以探索单细胞水平上的肽立体化学（图9），通过CE和MS对单个细胞的肽含量进行了表征。

Nemes等人使用光学引导的原位亚细胞毛细管微取样的方法对活脊椎动物胚胎进行采样，结合蛋白提取消化、毛细管分离肽、超灵敏纳米电喷雾电离和高分辨率MS检测，从5ng蛋白质样品中鉴定和定量了约750-800个蛋白质（图10）。

不过CE更适合分离大体积、蛋白质含量更多的胚胎、卵母细胞或神经元，与LC分离相比，分离效率低、重复性差，容易受到温度和pH等影响，所以尚未在单细胞蛋白质组学研究中得到广泛的应用。

总结

基于LC的分离方法可以在单细胞蛋白质组水平上实现蛋白质的初步检测。关于分离性能和优化的MS参数、TMT标记载体蛋白能够使单细胞蛋白的检测覆盖率的极大增加；为了解决单细胞检测过程中低通量的问题，可以使用微流体芯片、自动化设备和TMT标记的组合来提高。基于LC的分离方法还存在一些缺点，主要包括预处理时间长、单细胞样品稀释和损失、低丰度蛋白质分离和检测不足等，因此该研究仍有很大的发展空间。