定点诱变中引入所需的突变的三种主要方法

定点诱变（SDM）是一种在已知序列中产生突变的体外方法。它通常通过基于PCR的方法进行。通常，一个或两个碱基在定点诱变中改变。引物可以设计具有所需的突变，以引入核苷酸序列的微小变化。引物延伸和反向PCR可用于引入大规模突变。这种方法可能会改变特定蛋白质的氨基酸组成。定点诱变用于研究蛋白质活性的变化。它也用于制造融合蛋白。

三种主要类型的方法用于在定点诱变中引入所需的突变。它们是传统的 PCR、引物延伸和反向 PCR。引物延伸和反向PCR可用于引入大规模核苷酸变化。

传统PCR

传统的PCR可用于通过修饰的引物将一个或两个核苷酸变化引入靶序列。这些变化可以是核苷酸替换、删除或添加。突变在PCR过程中被掺入扩增子中。因此，原始序列被引物中的突变序列所取代。

引物延伸

在引物延伸中，在巢式PCR过程中掺入所需的突变。在这里，靶序列两侧是两个引物。将所需的突变掺入内部引物中，并在第二轮PCR中引入突变。通常，PCR反应的特异性随着引物中不匹配核苷酸数量的增加而降低。然而，具有大规模突变的长内引物可用于引物延伸，因为巢式PCR可以增加PCR反应的特异性。

反向PCR

反向PCR是一种通过将引物设计为已知DNA序列来扩增未知DNA片段的方法。它可用于大规模替换、删除或插入核苷酸。

定点诱变的应用如下所述。

1. 研究蛋白质的结构、功能和催化性质

2. 改善蛋白质的性质（蛋白质工程）

3. 引入或移除限制性核酸内切酶位点。