免疫沉淀技术之ChIP（2）

       上一期干货内容介绍了染色质免疫共沉淀（ChIP）的原理及其应用和实验步骤，从ChIP实验操作层面看相对简单，但是实验耗时长，通常需要至少一周的时间完成一次实验，过程繁琐，每一步都很考验实验操作技术，所以看似简单的实验其实需要注意的事项很多。在这一期，小编整理了ChIP实验中常见的问题，供大家参考学习，实验前一定要先熟悉各项实验细节。工欲善其事，必先利其器，下面我们一起来看下具体有哪些值得注意的问题吧。

1.       注意设置对照组

（1）Input DNA组：超声使染色质断裂后，得到未进行IP且经解交联的DNA。Input DNA是检查ChIP实验效率的参照，所以Input DNA对照是必须要设置的。

  （2）阴性对照组：一般将IgG设置为阴性对照，即在ChIP样本中加入IgG抗体。

  （3）阳性对照组：阳性对照一般使用已知与DNA序列结合且保守的蛋白抗体，例如H3组蛋白抗体或RNA pol II抗体。

2.       甲醛交联时间

不同实验条件和细胞类型，进行甲醛交联的时间不同，通常需要摸索优化交联时间。根据经验，一般使用1%的甲醛浓度进行交联，室温固定10-15分钟。时间太短的话，交联反应进行的不彻底，很多蛋白与DNA的结合不是很牢固，交联时间太长的话，会导致后续超声非常困难，而增加超声时间或功率会破坏目的蛋白本身的结构，进而导致ChIP结果不理想。

3.       细胞方面

ChIP实验所用细胞数量过多，将直接导致甲醛交联时间增加，切断染色质的过程中易造成裂解的DNA片段超过1000 bp，这些片段极易丢失，进而导致实验失败。最佳的DNA片段长度是200bp-1000bp。相反，如果过细胞数量太少，切断的DNA片段极可能小于100bp，或样本量不足。实验细胞用量多少合适，最好进行预实验摸索。

另一方面，保持细胞状态良好，避免更多的因素影响细胞中蛋白与染色质的结合。

4.       目标蛋白抗体

ChIP实验首选用ChIP级抗体，是实验成功的关键因素。ChIP级抗体识别的蛋白表位与WB和一般IP实验是有区别的，并且能够耐受高盐、低盐及多种去垢剂的洗涤。如果目标蛋白没有对应特异性抗体可用，除了定制抗体外，还可以给目标蛋白融合标签，通过标签蛋白检测目标蛋白。

5.       为什么有的ChIP要使用酶消化？有的也可以用超声破碎？

在N-ChIP中必须要使用核酸酶消化，因为蛋白不交联DNA，并且与超声处理碎裂有关的苛刻条件会导致染色质蛋白与DNA解离。而在X-ChIP中，酶消化或超声都可以用于切断染色质。与酶消化的染色质碎裂不同，超声处理依靠机械力来将染色质碎裂成更小的片段。可使染色质片段大小介于200-1000bp之间，这也是免疫沉淀的最佳染色质片段大小。

6.       ChIP超声时注意事项有哪些？

（1）超声波是使用机械力断裂染色质，容易引起升温或产生泡沫，这都会引起蛋白质变性，进而影响ChIP的效率。所以在超声波断裂染色质时，要在冰上进行，且要设计时断时续的超声程序，保证低温。另外，超声探头要尽量深入管中，但不接触管底或侧壁，以免产生气泡。总超声时间也不要太长，以免蛋白降解。不同细胞超声条件不同，超声条件需自己摸索。

（2）若超声时出现泡沫，立即停止超声，至于冰上。之后用冷冻离心机高速离心1分钟去除泡沫，继续超声。

7.       哪些步骤时，可暂停实验？

（1）细胞经“交联和收集细胞”步骤后，细胞可冻存-80℃备用。

（2）染色质断裂后（超声法或酶消化法），离心并转移的上清染色质，可冻存-80℃备用。

（3）染色质解交联后（DNA回收纯化前），可冻存于-20℃备用。DNA回收纯化后，可冻存于-20℃备用。

以上则是一些ChIP实验常见的问题啦，希望能对大家的实验有帮助。下期将继续介绍免疫沉淀相关的技术—RIP，感兴趣的小伙伴可以关注下~汉恒专注病毒包装十余载，如有技术问题或产品订购需求，欢迎随时咨询！