如何培养PDO？一网打尽类器官前沿实验方法，提升科研竞争力！
类器官转化技术是一种多功能工具，能够在体外生成和长期维持接近原生的3D上皮组织。通过原发性患者肿瘤组织生成的癌症类器官，可以测试多种治疗药物的反应。因此，患者来源的癌症类器官对个性化医疗有很大的前景。
今天小学社将与大家继续深入讨论类器官的世界了解更多类器官培养方面的技术和方法。分享大名鼎鼎的Hans Clevers教授在Nature Protocols杂志上发表的关于患者源类器官培养和药敏实验的文章。
癌症是一种严重的疾病，常规治疗方法如化疗、放疗和手术并不总是有效。因此，有必要开发新的治疗方法以提高治疗效果和生存率。患者来源的癌症类器官（PDO）是一种新兴的治疗策略，可以更好地模拟患者的生理环境，从而更准确地评估药物的疗效和毒副作用。本研究介绍了建立癌症类器官的详细方案，包括从患者来源的组织中提取细胞、培养类器官和进行药物筛选等步骤。这些方案可用于建立多种类型的类器官，如结直肠癌、膀胱癌等，并可应用于个性化医疗，为患者提供更优化的治疗方案。
1. PDO培养基本流程
A. 获得组织：组织类型主要是三种：正常组织、肿瘤组织和活检组织。
B. 处理样本：剔除非上皮组织（脂肪和肌肉组织）后，进行消化解离。
C. 加入培养基：接种到3D基质胶中，加入含有生长因子的培养基，通常包括：
Wnt信号通路激活剂；
酪氨酸受体激酶的配体（刺激上皮细胞增殖）；
TGF-β信号通路抑制剂（抑制上皮细胞分化）；
ROCK抑制剂（保持干细胞多能性）
D. 观察形成的PDO
E. 进行传代和药敏试验
2. 举例详细展示
研究人员在文章中以口腔粘液瘤为例进行了详细展示，首先取到组织，去除脂肪和肌肉组织后，用胰酶消化，每隔十分钟振荡重悬，解离时间不超过60分钟，然后用大量的培养基重悬，过100μm孔径的细胞筛，未消化完全的部分留在了细胞筛上方，用培养基清洗以去除胰酶，然后离心，用冷BME重悬，迅速滴注点板，BME胶凝固之后添加培养基进行培养，在第0、3、7天观察PDO的生长情况。
3. 头颈鳞癌（HNSCC）PDO培养详细步骤说明
研究人员将HNSCC的PDO培养做了一个长达89个步骤的建立过程，具体内容及需要注意的关键点如下：
组织收集和处理（步骤1-5）
最好选用呈现粉红色的活性高的组织块，在运输途中使用含有ROCKi Y27632的4℃培养基可以更好地保存。
从原代组织中建立产生类器官（步骤6-16）
分为以下几步：
1）把组织切成小块；
2）用各种酶消化成单细胞，比如胶原酶，胰酶，透明质酸酶等；
3）把细胞与基质胶混合后，以液滴的形式接种；
4）加入生长培养基培养。
不同种类的肿瘤PDO培养效率存在差异，头颈部鳞癌(HNSCC)约为70%，乳腺癌约为60%，结直肠癌约为90%。为了提高成功率，建议在第1-2代细胞培养期间，在培养基中添加10uM的Y27632。在开始的几天要密切观察是否有细菌和真菌的污染，如果发现污染，请在受影响的培养孔中加入5M的NaOH处理1小时，然后清洗污染的孔，用酒精进行处理，最后更换盖子。使用抗生素是必要的，并且要确保不受支原体污染。
类器官的传代和传代比例（步骤17-25）
如果使用TrypLE进行消化的话，要确保不要过度消化，每5分钟使用显微镜观察一次消化程度。如果观察到有纤维状或葡萄状的形态，需要使用机械力对其进行剪碎处理。
类器官的冻存和复苏（步骤26-42）
为了最大限度地提高高度增殖期类器官的复苏效率，常规做法是在传代后2-3天进行冻存。冻存单个细胞或已分化的大型类器官会导致复苏效率下降。建议在用于药物筛选之前至少培养一代经过冻存的类器官。
类器官药筛实验的准备（步骤43-50）
为药筛实验分配类器官（步骤51-57）
在进行药物筛选实验之前，可以使用Dispase来消化基质胶。随后进行洗涤和过滤，以去除较大的器官类群，这些器官类群可能会对实验结果产生较大的变异。
用感兴趣的治疗手段处理类器官（步骤58-74）
在基础医学科研中，设置阳性和阴性对照以及进行重复实验非常重要。对于化疗药物，可以通过各种移液工作站轻松进行操作。同样地，对于放疗实验，很方便地可以尝试多种不同的放射剂量。
药筛结果和数据分析（步骤75-88）
药筛结果解读
成功建立PDO（器官样体）与所用组织标本的质量息息相关，新鲜且富含上皮组织的样本更容易培养出PDO。因此，在实验初期，务必做好样本处理工作，将样本保存在4℃的DMEM/F12培养基中，并添加10μM的Y-27632，以更好地维持细胞的活性。
本文来源：类器官学社
