《Science》2月3日发表文章，报道日本理化学研究所(理研)生命医科学研究中心的古关明彦教授、千叶大学大学医学研究院细胞分子医学的大日向康秀讲师等人在世界上首次成功建立“原始内胚层干细胞(primitive endoderm stem cell；PrES细胞)”。

这项研究成果将有助于阐明仅由几十个细胞组成的早期胚胎能够产生个体生命的机制，并可能在未来实现仅仅使用干细胞就可以在试管中重建早期胚胎的工作。

在小鼠体内，受精卵3天后，形成囊胚，这是已经可以分出三种细胞，即未来形成胚胎的细胞(胚胎干细胞)、成为胎盘的细胞(滋养层细胞)以及成为卵黄囊的细胞(原始内胚层细胞)。此前，人类已经培养了胚胎干细胞（ES细胞）和滋养干细胞（TS细胞），但是培养出有功能的PrES细胞这还是第一次。

联合研究小组发现，通过在特殊培养基中培养小鼠胚泡，可以建立PrES细胞。同时发现将PrES细胞注入囊胚后，迅速进入原始内胚层，有助于卵黄囊的派生。另外，将PrES细胞注入到原始内胚层缺失的胚泡中（原本应该很早就死亡的胚胎），结果所有的原始内胚层序列组织形成了，最终诞生了正常的小鼠。

背景

我们的生命只从一个受精卵开始，受精卵重复卵裂，最终形成称为“囊胚”的早期胚胎。囊胚主要是由数十个细胞组成的组织，具有衍生胚胎的“表囊”、衍生胎盘的“滋养膜”、衍生卵黄囊的“原始内胚层”三个细胞系谱。在小鼠受精后10天内卵黄囊是必要的，以支持胚胎发育。

到目前为止，虽然人类从表囊中建立了ES细胞(胚胎干细胞)，从滋养膜中建立了TS细胞(滋养干细胞)，但还没有实现残留的原始内胚层干细胞(primitive endoderm stem cell；PrES细胞)的建立。

另外，近年来，仅使用干细胞重组胚胎的研究备受关注，但仅靠以往的ES细胞和TS细胞，制作囊胚的“部件”不够，必须要建立残留的PrES细胞。

囊胚由表囊(红)、营养膜(绿)、原始内胚层(蓝)3种，共数十个细胞组成(左)。胚胎来自表囊，胎盘来自营养膜，卵黄囊(壁侧内胚层、脏层内胚层、交界区内胚层)来自原始内胚层。

研究方向与成果

联合研究小组将小鼠胚胎泡置于不同的培养条件下，并探索建立和维持PrES细胞的条件。结果，通过向无血清培养基中添加糖原合成酶3(GSK3)抑制剂CHIR99021、成纤维细胞生长因子FGF4、抗凝血药肝素、血小板衍生生长因子PDGF-AA 4，成功建立了PrES细胞。

对建立的PrES基因分析发现，同ES细胞、TS细胞都表现出不同的基因表达模式，与受精后第4.5天胚胎形成后不久的原始内胚层非常相似。

接下来，将PrES细胞注入囊泡以分析PrES细胞的功能，细胞迅速进入原始内胚层。原始内胚层是派生壁侧卵黄囊的壁侧内胚层、脏卵黄囊的脏层内胚层、边界区域内胚层的组织。将注入PrES细胞的囊胚移植到假孕小鼠的子宫中，PrES细胞有助于壁侧内胚层、脏层内胚层、交界区内胚层的全细胞派生，囊胚细胞和PrES细胞混合，最终发现它维持了胚胎形成的能力。

作者还研究了将PrES细胞注入缺失原始内胚层的胚泡中是否可以防止胚胎死亡，结果显示PrES细胞衍生出所有原始内胚层序列的组织，并产生了一窝正常的小鼠。这一结果意味着PrES细胞具有补充原始内胚层的能力。

PrES细胞的建立使构成囊胚的所有细胞的干细胞聚集在一起(图2)。

ES细胞主要形成胚胎，TS细胞主要形成胎盘，PrES细胞主要形成卵黄囊。三种干细胞聚集在一起，覆盖了所有的受孕产物。

作者还研究了在试管内组合三个干细胞是否可以人工制造胚样结构。通过使用特殊培养皿，依次组合培养ES细胞、TS细胞、PrES细胞，然后对制作的组织(ETP复合体)进行单一细胞基因表达分析，发现可以在一定程度上再现胚胎着床前后的过程。将ETP复合体移植到假妊娠小鼠的子宫中，移植的复合体中有30%左右着床。然后在怀孕7.5天，发现它形成了一个类似于由壁侧内胚层样和脏层内胚层样的双重卵黄囊包围的胚胎结构(图3)。

左：ETP复合物移植到假妊娠小鼠子宫后，衍生出胚样结构。左边是明视野，右边是绿色荧光蛋白(GFP)，显示PrES细胞的贡献。虚线表示ETP复合体和子宫的边界。

中：左是正常受精的第7.5天胚胎，右边是从ETP复合物衍生的妊娠7.5天胚样结构。ETP胚样结构被内胚层标记SOX17阳性(红色)双重卵黄囊样片包围。Hoechst(蓝色)是DNA染色。

右：放大了中间那个方形部分的图像。从右边ETP复合物衍生的胚样结构显示壁侧内胚层样(PE-like)和脏层内胚层样(VE-like)。

评述和期待

作者古关明彦表示："本研究有助于我们了解由几十个细胞组成的囊胚如何发挥生命起源的功能。我们还在研究与人类细胞更相似的猪细胞，希望能有所突破。

京都大学iPS细胞研究所的Yasuhiro Takashima教授认为这是一个非常有趣的结果。让人类可以更好理解卵黄囊在胚胎生长中的作用，未来我们可以将从小鼠身上获得的知识用于人类。

当前，不使用类似自然的精子和卵子形成的胚胎，而是仅仅利用干细胞来制造人工胚胎的研究，是目前世界生物领域竞争最为激烈的领域。无论在美国、澳大利亚还是日本，都在你追我赶的在该领域争取早日取得突破。

此次日本的研究，标志着人类首次培养成功PrES细胞，意味着人工胚胎的制作和人工生命的研究迈出了重要一步。

参考文献：Yasuhide Ohinata*，Takaho A.Endo，Hiroki Sugishita，Takashi Watanabe，Yusuke Iizuka，Yurie Kawamoto，Atsunori Saraya，Mami Kumon，Yoko Koseki，Takashi Kondo，Osamu Ohara，Haruhiko Koseki，“Establishment of mouse stem cells that can recapitulate the develeScience, 10.1126/science.aay 3325

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