欲挽雕弓照免疫 放马由缰尽杀敌（一）
前言：单克隆抗体和癌症免疫疗法的过去，现在和未来
2018年10月1日，诺贝尔生理学与医学奖如期颁布——来自美国休斯顿德克萨斯大学MD安德森癌症中心的Dr. James Allison（詹姆斯·埃里森）博士和日本京都大学的Dr. Tasuku Honjo（本庶佑）因他们“在肿瘤免疫治疗中的奠基性发现”而分享了这一生物界的最高奖项（图1）。这是免疫学领域继2011年的Toll样受体和DC细胞之后，又一次，也是迄今为止最近一次摘得生理学与医学奖的桂冠。
通过本文，我们将追溯「免疫治疗」这一兼具历史传奇色彩和新型前沿科技的癌症疗法，介绍这场由无数科学家大胆开拓、拾级而上，跨越百年长河实现的生命接力；更重要的是，我们希望能够从这一届生物学诺奖的主题出发，在追根溯源之中知其然而知其所以然，展示历史上伟大的科学家们是如何以脱离平庸的独特视角“删繁就简三秋树，领异标新二月花”，于灵感迸进的火花中诞生出从零到一的诺奖级突破；又是怎样以不可动摇的坚强信念“千磨万击还坚劲，任尔东西南北风”，以日复一日的躬耕中在质疑和否定中捍卫和证实了自己大胆的猜测——正是这些宝贵的精神财富，创造了生理学与医学的今天，更拯救了无数人的生命。
当下，随着ChatGPT的诞生和众多人工智能、语言模型的不断迭代进化，单纯的「知识内容」和「逻辑框架」早已不再是我们独有的强项。总有一天，当我们彻底摘下名为「博物」的帽子，当我们最终放下繁复而沉重的知识行囊，当我们穿透「智慧就是记忆力」的脆弱外壳，来审视自己的内心——我们不禁要问，作为一名生命科学领域的科研工作者，我们最终剩下的，也正是未来的生命科学所真正呼唤的，究竟是何种素质，又是哪些能力？
（图片来源于诺贝尔奖官网https://www.nobelprize.org/prizes/）
这是他们的故事；
也是我们的故事。
作者｜清华大学生命科学院 张润恒
2014年7月7日，美国百时美施贵宝（BMS）的单克隆抗体药物Opdivo（纳武利尤单抗，简称O药，图2）在日本被批准上市，用于治疗黑色素瘤。
全球第一个上市的靶向PD-1的抗体药！这是免疫学与癌生物学史上里程碑式的事件，它标志着用免疫学手段治疗癌症的方法终于在百年奋斗之后，从生物制药的前沿领域登上了世界中心的舞台。它的竞争对手，一种同样靶向着PD-1信号通路的抗体药——默沙东的Keytruda（帕博利珠单抗，简称K药，图2）紧随其后，于同年9月4日顺利通过审核，并被美国食品药品监督管理局（FDA）授权加速批准为治疗晚期黑色素瘤的药物。在此后的许多年里，这两种药物将作为癌症免疫治疗领域的坚实力量，为无数病人带来希望。
或许很少有人会注意到，这两种新药的问世，实际上可以算是免疫学界20-21世纪两大诺奖成就“珠联璧合”的结果。「单克隆抗体」（1984年生理学与医学奖）和「癌症的免疫检查点疗法」（2018年生理学与医学奖），这两颗从上世纪70年代至今，在四十余年不懈努力中孕育出的璀璨明珠，一点点从发现(breakthrough) 到发展 (develop)，最终成长为得以投入工业生产(industrialization)，造福人类、乃至改变世界的医疗手段。这一历程不仅需要众多科学家、医药人和企业家们坚定的选择和艰苦的奋斗，也需要大众、政府和投资界的理解、信任以及长期一贯的支持。
在这条遍布荆棘的赛道上，无数前行者们不断探索，尝试；合作，竞争；冒险，牺牲。他们交织科学的手段与人性的光辉，谱写着一首首壮丽恢弘的免疫诗篇。
第一篇 从抗体到杂交瘤细胞和单克隆技术
花开两朵，各表一枝。在讲述各种免疫检查点蛋白质、信号通路及其抑制剂的研究兴起之前，我们先来看一看更早登上历史舞台，并被写进无数本教科书的「单克隆抗体」是怎样在时代的需求、难得的机遇与思维的火花之下得以诞生，又是如何在众多科学家的努力下一步步攻坚克难，不断向着「全人源化」这一抗体界的喜马拉雅之巅奋力攀登。
荒林万木春
抗体分子的故事最早从1890年的德国科赫研究所开始。这一年，研究所的Emil Adolf Behring和北里柴三郎（图3）发表了一篇重磅论文——“论动物对白喉和破伤风的免疫力的建立”(Behring and Kitasato,1890）。这篇历史性的文章开创了“体液免疫”的概念，首次报道了白喉毒素和破伤风毒素的抗毒素的存在——他们发现的“抗毒素”被描述为一种在无细胞血清中发挥着中和细菌毒素的“免疫作用”的物质，也就是现在家喻户晓的「抗体」。
随着抗体理论的逐渐成熟，科学家们不禁开始设想又一次从科学理论到技术实践上的飞跃——如果把抗体作为一种“蛋白药”，利用它特异性结合靶蛋白、阻断反应和诱导免疫的功能，或许许多小分子药物固有的缺陷就能够得以解决，更多难治的顽疾将会得到治疗。
使用抗体和抗体-药物结合物 (ADC) *作为药物无疑具有很多天然优势。通过蛋白质相互作用，抗体和靶点可以高度特异、紧密地结合，和经常“滥杀无辜”“敌我不分”的小分子药物相比，有更小的副作用和毒力；抗体可以针对特定的靶向蛋白直接生产出来，不需要通过筛选、设计和试验等复杂过程从多种小分子中寻找有效药物；除此之外，从药理学角度讲，作为大分子蛋白质的抗体在体内半衰期更长，一次注射可以保持药效两、三周甚至超过一个月。更高的特异性、更直接的生产思路、更长的半衰期 (Liang Ma et al,2017)，抗体作为一种有靶向性的「大分子」吸引着许多科学家。
然而，从理想到现实的路上还横亘着两座大山——抗体分子的“生产”和”提纯“。把抗体做成专一而稳定的药物试剂，而非直接为患者注射血清，就必须得到有较高单分子纯度和足够稳定性的抗体化合物——而这样一来，在生产和提纯上的困难就成为了阻挡这一理论实践化的难题。
用靶分子免疫动物获得的血清中，浓度有限的总抗体来源高度复杂、靶点高度异质、分子类型和功能高度多样；这样的样品往往具有过低的目标浓度和过多的杂蛋白，给基于从天然样本中进行分离纯化的传统蛋白质获取方案带来了很大困难。直接从抗血清中层析得到抗体的过程成本高昂、效率极低；即使是最有特异性的亲和层析，因其只考察互作的发生而不考察具体的结合靶位，也无法一一分离出针对单靶点的同质化抗体。在亲和层析以及其他生化实验技术的帮助下，人们只能获得靶向单一分子，但实际上结合着目标上成千上万个不同表位(epitope)的多种异质性抗体的混合物。这就是我们常说的「多克隆抗体」。
不过，既然异质性的多克隆抗体（理论上）都针对着同一靶蛋白，那么在实际科研和医学临床中就直接使用这些抗体进行试验和治疗，又能有什么问题呢？
事实证明，盲目地使用多克隆抗体会带来很多问题，而且其中大多数相当致命。首先，从血清中分离纯化出的针对多个不同抗原决定簇（即表位）的一份多克隆抗体试剂中，只有0.5-5%的抗体分子能够结合预期目标(Bradbury and Plückthun, 2015)，效率很低；其次，多克隆抗体试剂在很多实验室的抗体验证工作中明显表现出特异性的缺乏(Jennifer Bordeaux et al, 2018，图4)。更多的问题还包括难以避免的批次效应：多克隆抗体试剂的功能因批次而异，因为通过免疫动物的方法——即使用一模一样的动物——也不会针对一个多表位的单分子产生两组完全相同的多克隆抗体混合物。这就使得研究人员很难确定以这种方式获得的任何特定批次的多抗试剂的特异性(Bradbury and Plückthun, 2015)。
遗憾的是，即使早已达成单克隆抗体这一技术思路上的伟大飞跃，「抗体试剂特异性是否可靠」的幽灵仍广泛潜伏在如今基于抗体进行的各项生物与医学研究中，时时威胁着各项实验结果的准确性和可重复性(Fredirik Edfors et al, 2018; Jennifer Bordeaux et al, 2018；Bradbury and Plückthun, 2015)。科学家们不断呼吁对抗体试剂的特异性、选择性和可复制性加以重视，提倡统一要求使用无目标外抗体污染、并严格针对单一表位的单克隆抗体试剂（完全排除多克隆抗体），并提出各种实验策略来验证公司生产的抗体工具是否有效性可靠。
当然，这些都是后话。无论这一产生于70年代的生产方案是否真正彻底解决了实际上的种种困难，它还是在已有的抗体无法满足各方面需求的情况下，将人们从以实验动物血清作为来源和蛋白质分离纯化技术为基础的传统方法转变到以相对微观化、以细胞而非生理生化为主导的框架之中，从以细胞为生产者的角度开辟了「单细胞来源、单克隆生产」的全新道路。
时势造英雄
毫无疑问，1927年是中国近代史上决定性的一年——中共联合国民党左派在江西南昌打响了武装反抗国民党反动派的第一枪，揭开了中共独立领导武装斗争和创建革命军的序幕，史称“八一起义”。
在南昌的枪声打响两个月后，世界的另一边、距离我们两万多公里外的阿根廷布兰卡湾的一个犹太移民家庭中，塞萨尔·米尔斯坦(图5，Cesar Milstein)出生了。
19世纪末20世纪初，摆脱了西班牙殖民统治的阿根廷开始飞速发展。依靠着本国地理环境带来的巨大农牧业优势，随着国际市场羊毛需求的激增以及冷冻技术的发展，阿根廷的羊毛、牛肉、小麦等农产品开始出口到欧美各地，攀升至世界最主要的农产品出口国之一。凭借强大的农业，20世纪初阿根廷已经成为世界第五大出口国，在短短几十年间成为了世界最富有的经济强国之一。
在这种蓬勃发展的时代背景下，外来移民对阿根廷人口结构的影响超出了任何其他西半球国家。无论是胜似西欧的拉普拉塔平原上肥沃的土地、水草丰美的潘帕斯草原，还是阿根廷市场现状对于劳动力的迫切需求，都吸引着众多欧洲移民从南欧，特别是意大利涌入阿根廷。从1857年到1930年，外来移民构成了阿根廷大约60%的人口增长。
彼时的阿根廷，还是拉丁美洲名副其实的“科技强国”。实证主义和激进党的崛起不仅为阿根廷政界带来了“和平与管理“的口号和繁荣的经济氛围，也有力地推动了阿根廷的基础科学建设。阿根廷举国上下高度重视科学研究和科学教育，将9月29日（阿根廷发明家拉斯洛·比罗的生日，他发明了圆珠笔）专门定为“发明节”，鼓励青少年钻研探索、发明创造。就是在这样重视科学、重视教育的背景下，三位诺奖得主从阿根廷的学术沃土中成长起来——其中两位是法国移民血统，而另一位犹太移民血统的诺奖得主，也是阿根廷的第二位医学奖得主，就是我们的主人公塞萨尔·米尔斯坦。
米尔斯坦的父母都是移民，和当时的许多父母一样，他们经济基础一般，但无比重视子女的教育。用米尔斯坦自己的话说，“No sacrifice was too hard to make sure that their three sons would go to university”.作为三兄弟中的二哥，他于1944年进入布宜诺斯艾利斯大学 (UBA，Universidad de Buenos Aires, 阿根廷最大的综合性大学，五位诺奖得主的摇篮) 就读，并于1957年发表关于醛脱氢酶的论文，获得博士学位。
米尔斯坦人生的第二个阶段在英格兰和自己的家乡之间反复往来。在英格兰，他凭借英国议会的奖学金，继续搞他的生物化学研究——与那个年代的许多微观生物学家一样，他的兴趣仍然集中在生物化学，确切地说，是酶学上。他在那里研究磷酸葡糖变位酶被金属活化的机制，也正是因此而结识了改变了他一生的合作伙伴——生物学界硬核狠人弗雷德里克·桑格（Frederic Sanger）。
其实马后炮来看，这两位诺奖得主的背景可以说是有许多相似之处——两人都不是什么“优等生”“理工男”，所学课业的纸面成绩不高，喜欢搞课外活动（Sanger喜欢研究非考试科目的生物，米尔斯坦在学生会非常活跃），家庭环境较为宽松，而且父母开明并善于教育。当时是1958年，年方四十的Sanger刚刚因他在生化领域做出的革命性贡献——发明蛋白质测序方法而获得诺贝尔奖，正是意气风发的时候。米尔斯坦和Sanger合作完成了他的第二个博士学位论文，而后返回了故乡阿根廷，在自己的母校布宜诺斯艾利斯大学担任国家微生物学研究所分子生物学部门的主任。
米尔斯坦为何要在此时返回阿根廷？无论是对于亲友的牵挂、故乡的怀念，还是希望带领更多后辈走向科研之路，建设自己的母校和国家，这些我们都不得而知。他可能没有想到，他回到阿根廷所期冀的一切，都将在两年间化为泡影。
其实马后炮来看，这两位诺奖得主的背景可以说是有许多相似之处——两人都不是什么“优等生”“理工男”，所学课业的纸面成绩不高，喜欢搞课外活动（Sanger喜欢研究非考试科目的生物，米尔斯坦在学生会非常活跃），家庭环境较为宽松，而且父母开明并善于教育。当时是1958年，年方四十的Sanger刚刚因他在生化领域做出的革命性贡献——发明蛋白质测序方法而获得诺贝尔奖，正是意气风发的时候。米尔斯坦和Sanger合作完成了他的第二个博士学位论文，而后返回了故乡阿根廷，在自己的母校布宜诺斯艾利斯大学担任国家微生物学研究所分子生物学部门的主任。
米尔斯坦为何要在此时返回阿根廷？无论是对于亲友的牵挂、故乡的怀念，还是希望带领更多后辈走向科研之路，建设自己的母校和国家，这些我们都不得而知。他可能没有想到，他回到阿根廷所期冀的一切，都将在两年间化为泡影。
其实马后炮来看，这两位诺奖得主的背景可以说是有许多相似之处——两人都不是什么“优等生”“理工男”，所学课业的纸面成绩不高，喜欢搞课外活动（Sanger喜欢研究非考试科目的生物，米尔斯坦在学生会非常活跃），家庭环境较为宽松，而且父母开明并善于教育。当时是1958年，年方四十的Sanger刚刚因他在生化领域做出的革命性贡献——发明蛋白质测序方法而获得诺贝尔奖，正是意气风发的时候。米尔斯坦和Sanger合作完成了他的第二个博士学位论文，而后返回了故乡阿根廷，在自己的母校布宜诺斯艾利斯大学担任国家微生物学研究所分子生物学部门的主任。
米尔斯坦为何要在此时返回阿根廷？无论是对于亲友的牵挂、故乡的怀念，还是希望带领更多后辈走向科研之路，建设自己的母校和国家，这些我们都不得而知。他可能没有想到，他回到阿根廷所期冀的一切，都将在两年间化为泡影。
当米尔斯坦于1961年回到祖国的时候，二战已经结束，但他等来的是一个比自己离开之前更加不堪的阿根廷社会。过于依赖农业和欧美资本为阿根廷经济的衰落埋下了隐患，加上在三次工业化浪潮中都没有抓住机会利用自己的优势进行转型，在工业化逐渐占据全球经济主体的过程中，曾经的经济强国已然好景不长。二战之后，阿根廷国内军人专政，庇隆主义、罗萨斯政府等势力轮番登台，国内政局动荡不安，又遭到了美英为首的西方集团的经济打压。一时的繁荣已经逝去，动荡的阿根廷社会充满危险，仅凭一己之力，米尔斯坦几乎无法改变什么。
其实马后炮来看，这两位诺奖得主的背景可以说是有许多相似之处——两人都不是什么“优等生”“理工男”，所学课业的纸面成绩不高，喜欢搞课外活动（Sanger喜欢研究非考试科目的生物，米尔斯坦在学生会非常活跃），家庭环境较为宽松，而且父母开明并善于教育。当时是1958年，年方四十的Sanger刚刚因他在生化领域做出的革命性贡献——发明蛋白质测序方法而获得诺贝尔奖，正是意气风发的时候。米尔斯坦和Sanger合作完成了他的第二个博士学位论文，而后返回了故乡阿根廷，在自己的母校布宜诺斯艾利斯大学担任国家微生物学研究所分子生物学部门的主任。
米尔斯坦为何要在此时返回阿根廷？无论是对于亲友的牵挂、故乡的怀念，还是希望带领更多后辈走向科研之路，建设自己的母校和国家，这些我们都不得而知。他可能没有想到，他回到阿根廷所期冀的一切，都将在两年间化为泡影。
The political persecution of liberal intellectuals and scientists manifested itself as a vendetta against the director of the institute where I was working.
在上级死于政治迫害之后，深感自己身处危机之中的米尔斯坦最终离开了那个已经无法再保护他的祖国。他将自己余下的科研生涯在剑桥燃尽，此后的四十年里，米尔斯坦再也没有带着学术成果回到阿根廷。
不过，对于米尔斯坦来说，他学术上的辉煌在当时才刚刚开始。1963年，米尔斯坦回到剑桥，发现曾经的合作伙伴Sanger进入了剑桥医学研究委员会新成立的分子生物学实验室，并在那里担任着蛋白质化学部的主任。在Sanger推荐下米尔斯坦加入了剑桥分子生物学实验室，也就是在这时，他听从好友的建议，将自己的研究方向从酶学转向了免疫学。
很多诺奖得主都有过“跳槽”经历。事实证明，当大家都堆在那里刷那些“旧热点”“大科目”时，你要是想研究出点成果，与其跟着别人往已经差不多搞到头了的课题里卷，还真不如去未知的新领域里面试试水。毕竟，对于当时的生物学科来说，还没开挖的矿山尚且有一大堆，老去跟着别人吃剩饭、做修补，怎么能让你轻松搞出突破？去挖大佬挖过的旧井，怎么能比自己去开拓新天地更加让人兴奋？
在60年代还不算成熟的细胞生物学界，有两个非常热点的话题。
激荡的时代
其一便是多发性骨髓瘤(图6，multiple myeloma,MM，也称为浆细胞骨髓瘤)。和其他肿瘤疾病一样，这种癌症也源于一种或多种细胞的不可控性增殖，只不过，这一次增殖的细胞有点特殊。
浆细胞，顾名思义，具有分泌抗体的活性。当时免疫学研究已经确定，浆细胞源于B淋巴细胞对于抗原的应答。在产生较强亲和力抗体的TD抗原应答过程中，B淋巴细胞通过其表面的BCR受体识别TD（胸腺依赖性抗原）上特异的抗原决定簇（即第一信号），并接受Th（辅助性T细胞）通过表面分子相互作用（如CD40-CD40L）和分泌细胞因子的方式所提供的辅助刺激信号（即第二信号）而得到激活。被激活的B细胞最终分裂分化为浆细胞和记忆性B细胞，而浆细胞作为终末细胞理论上不再具有增殖能力，大部分将在两周内发生凋亡。
然而，在多发性骨髓瘤中，意义不确定的单克隆浆细胞并不停止增殖，而是具有了不断分裂和永生化的能力——或许是源于IgG重链基因和致癌基因之间的一次染色体易位（然后进一步导致基因组失稳和无限增殖，在许多案例中发现）。它们产生异常的抗体和细胞因子，并通过组织分解、过量抗体沉积和定殖扩增导致患者骨痛、骨骼分解和血钙升高、贫血、肾功能受损和发炎等症状。这种病变通常发生在脊柱和肋骨中，并被发现为血液和骨骼异常。在少数病例中，骨髓瘤进一步发生遗传变化，进入循环系统，并发展为最恶性的浆细胞白血病。
骨髓瘤细胞促进了人们对于抗体的生化理解，并且在细胞层面上为人们提供了一个抗体不知疲倦的“生产商”。然而，骨髓瘤生产出来的抗体多为异常，而且由于源群体基数广大且异质性强，人们难以随意控制抗体的靶点，也无法直接通过骨髓瘤单细胞扩增的办法达成单克隆化。单克隆抗体的目标有了生产工厂，但我们仍然需要设计蓝图。
当时细胞生物学界的另一项进展，细胞融合技术，对这种需求来说无异于是雪中送炭。19世纪30年代细胞病理学上多核细胞的发现为细胞融合技术打开了道路。1962年，日本科学家发现日本血凝型病毒能引起艾氏腹水瘤细胞融合；1965年，英国科学家对灭活病毒引发动物细胞融合的过程做了进一步证实。能够诱发细胞融合的技术的产生意味着，任何细胞理论上都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源，而这种特性，恰恰对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。
到这里，时代已经走到了节点位置。单克隆抗体该如何产生？在细胞和免疫学中，答案呼之欲出。
谁来做蓝图，谁来当工厂？谁来助融合，谁来搞筛选？万事俱备，只欠东风！
当时米尔斯坦在剑桥领导的团队正在努力尝试将小鼠的骨髓瘤细胞系和其他各种细胞进行融合，并检查各种杂交方案下细胞的免疫球蛋白表达情况。在此之前，一些研究者已经验证了骨髓瘤细胞和不产抗体的细胞之间的融合情况——将骨髓瘤细胞融合成纤维细胞会阻断原来的抗体分泌，而在融合不产生抗体的淋巴瘤细胞后则会继续分泌非特异性抗体（Periman,1970;Coffino,1971;Mohit,1971)。米尔斯坦自己领导的研究则在此基础上证明了：在融合双方都是抗体分泌细胞系时，产生的杂交瘤细胞同时具备分泌双方母细胞抗体的能力（Cotten and Milstein,1973）。但是，这种情况下细胞混合物产生的总抗体特异性不佳。
从简单的结果到能够付诸实际的生物技术，他的实验室仍需一种手段来解决筛选问题。
有趣的是，后来的补充研究发现，Milstein这种融合实验能够成功应用到单克隆抗体的生产上，实际上有一定的运气成分(Rajewsky, 2019)。骨髓瘤细胞明显倾向于和脾脏细胞融合，而不是在老老实实接受脾脏细胞之前就先发生大规模的自体融合——这才是大多数癌细胞所拥有的细胞学特征(Daria M.2021)。或许就如同豌豆选择了孟德尔，果蝇选择了摩尔根——或许真的是骨髓瘤细胞，选择了米尔斯坦。（为自己的研究课题寻找到合适的研究对象非常重要！）
如果当时真的卡在了特异性筛选的这一关上，米尔斯坦或许仍会因为他在杂交瘤细胞方面的贡献获得诺奖，但他终将与“发明单克隆抗体生产技术”这一桂冠差之毫厘，就失之交臂。
然而历史告诉我们，米尔斯坦并不需要遗憾。因为在这个节骨眼上，一位决定性的人物来到了他的实验室。他就是与米尔斯坦一同分享了1984年诺贝尔奖的——乔治·科勒(图7，Georges Jean Franz Kohler)。
或许是因为时代热点所趋，或许是因为米尔斯坦的细胞融合实验为他在免疫和细胞界带来的影响力，亦或许是因为米尔斯坦对于青年科学家的重视，让这位不到三十岁的年轻人在完成了博士学位之后，随即拜到他名下做博士后。科勒自己在本科毕业于弗赖堡大学之后，先是留在母校（1971）做了一些大肠杆菌修复缺陷型的研究，随后又到了位于瑞士的巴塞尔免疫学研究所（1974）进行有关β-半乳糖苷酶的免疫学实验，并得到了弗赖堡大学的博士学位。
1974年4月，两位英雄见面了。科勒来到米尔斯坦的淋巴细胞融合实验室，带来了一份关键信息。
在巴塞尔免疫学研究所攻读博士的短暂经历让科勒知道，当任的研究所所长 Niels Jerne 设计了一种可专一筛选分泌特异性抗体的浆细胞单克隆的方法(Jerne and Nordin, 1963)。这一筛选方法与细胞免疫学上经典的B细胞功能检测手段「溶血空斑实验」*颇为相似——他们在含有绵羊红细胞（Sheep Red Blood Cell, SRBC）的琼脂平板上涂布细胞悬液，并通过观察平板内接触浆细胞的SRBC因为免疫反应溶解而出现的斑块（plaque）来筛选分泌针对SRBC单一抗原抗体的浆细胞。其基本原理可以理解为微生物学实验中的稀释倒平板，也就是在稀释到合适的浓度之后，如果忽略多代扩增中新产生的突变，平板上每一个分布着的单独的菌落/斑块都可以视为是由一个单一的母细胞不断增殖形成的单细胞克隆群。只要将SRBC用其他抗原包被，这一方法就可以推广用于筛选分泌任意目标蛋白的抗体的浆细胞克隆。
临门一脚！科勒带来的思路几乎完美互补了米尔斯坦的既有成果。米尔斯坦的融合细胞可以无限扩增并生产单细胞来源的抗体，但融合细胞群整体缺乏特异性；科勒的方法可以筛选出来高度特异性的淋巴细胞，但这些淋巴细胞存活时间短且无法实现克隆扩增，无法用于抗体生产。师徒一拍即合，这张世纪拼图终于迎来了最后一块。
在两人的原始实验（图8，Köhler G,Milstein C,1975；Rajewsky,2019)中，他们从SRBC免疫过的小鼠脾脏内提取细胞，将它们和P3-X67Ag8 骨髓瘤细胞系融合，并置于SRBC平板上进行培养。这一系的骨髓瘤细胞缺乏TK或HGPRT，在预先加入了氨基蝶呤(A)*、次黄嘌呤(X)和胸腺嘧啶(T)的HAT培养基中，由于氨基喋呤(aminopterin)阻断了核苷酸的从头合成途径，细胞必须利用核苷酸代谢上的另一条通路——补救途径合成核苷酸才能够生存。而这一技术使用的P3-X67Ag8骨髓瘤细胞系是代谢缺陷型，没有TK（胸苷激酶）和HGPRT（次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶），因此无法进行补救合成；只有融合了其他细胞的骨髓瘤才能够得到拯救。随着培养和传代，这些失去了维持和复制原料的瘤细胞会迅速死亡；未融合骨髓瘤细胞的浆细胞本身不具有传代能力。
很快，平板上就只会剩下经历了细胞融合过程的瘤细胞——能对SRBC上单一的抗原产生抗体的杂交细胞，和骨髓瘤融合悬液中其他杂细胞生成的杂交细胞。而在足够大的稀释浓度下，只有产生抗体的的单克隆群体才能通过平板上的溶血空斑得以被实验者发现。每一个不同的空斑都代表着一个产生结合SRBC单一抗原的单细胞克隆群，这些空斑群靶向着相同抗原蛋白（即SRBC单一抗原），而每一个克隆群抗体又有着自己独特的，由母细胞继承来的对于特定抗原决定簇的亲和力。
1975年，两人合作的论文在Nature上发表。当时在德国科隆大学(Universität zu Köln)任职的免疫学家Rajewsky 在为Nature撰写的新闻稿中评论道“我当时立刻意识到我们的研究领域迎来了一个转折点。”
批量生产的不易，特异筛选的困难，在杂交瘤细胞和HAT培养基面前迎刃而解。随着他们设计出的实验方案最终发表，这一生物学史上和基因工程齐名的“19世纪两大革命性突破”几乎被完全解决。米尔斯坦和科勒在考虑单克隆抗体生产的问题时，并没有坚持尝试去改进原有的生化方法；他们从自己擅长的研究领域出发，看到了原有方法在视角上的固有缺陷，认识到以成体动物作为生产来源、用层析方法进行分离的巨大局限性，并因此做了底层定位和基本思路上的转变。
这样的转变虽小，但恰恰有着革命性的意义。世人都知道细胞融合实验和杂交瘤，但知道这两个方法怎么去用能碰撞出新的火花，解决世纪难题，值一个诺贝尔奖；世人都知道细菌有免疫外来入侵的能力，但知道这样的能力可以借用来构建真核生物基因编辑系统，发明基因剪刀，又值一个诺贝尔奖。
如果说细胞学方法是一个支点，米尔斯坦则手握着那根重要的杠杆；从小培养起来的科学思路、对于领域知识的整合与理解，和无比敏锐的洞察力——这些，让站在细胞生物学最前沿的他看到了撬动地球的无限可能。答案呼之欲出之际，四十年来的积累让他率先喊出了答案，他也因此成为了英雄。米尔斯坦和科勒的成功，无疑是及时的，是幸运的，更是水到渠成的。这是偶然的积分，也是必然的结论。
提取抗体的老办法粗鄙而勉强，新生的杂交瘤实验完整而美丽。一般情况下，只要思路上的大问题解决了，技术上的缺憾，都不算啥大难题；不过杂交瘤实验离完全成功，还差关键的一小步。
在前面介绍杂交瘤细胞的时候，我们还提到过这些细胞自身具有分泌非特异性变异抗体的能力，因此对米尔斯坦和科勒来说，他们的第一代杂交瘤技术还存在缺陷。实验中，P3-X67Ag8 骨髓瘤细胞系就会内在性地分泌自身基因组编码的抗体，因此他们获取的第一代单抗中实际上掺有骨髓瘤细胞自体分泌的非特异性抗体抗体。不过很快地，Rajewsky补上了这关键一步。一类不会内在性地分泌骨髓瘤来源非特异性抗体的X63-Ag8.653骨髓瘤细胞系被他的研究团队成功分离出来，而这个细胞系，恰恰很好地解决了第一代杂交瘤细胞的上清提取液中两种抗体混杂的问题(Galfre and Milstein,1981; Kearney et al.,1979)。
到此为止，针对单一抗原分子上特定决定簇的同质性单克隆抗体终于被生产出来。单克隆抗体技术和基因克隆技术相结合，为临床诊断和疾病治疗提供了崭新的方法和宝贵的工具，也为分离和鉴定新的蛋白质和基因开辟了一条无比广阔的新途径。1984年，诺贝尔生理学或医学奖授予 Milstein、Köhler和利用绵羊血平板筛选特异性抗体及浆细胞方法的初始发明人——Jerne。一位融合工厂与蓝图，一位发明筛选的手段，一位将二者以合适的方法、在恰当的时机串联起来，合作提出了最终的技术。实至名至，众望所归。
伟大的抉择
随着诺贝尔奖的颁发，单克隆抗体的故事似乎已经告一段落。但是，对于已经获得了诺贝尔奖，功成名就的米尔斯坦和科勒来说，他们所得到的可不仅仅是诺贝尔奖的二两奖金——单克隆抗体的专利权，还握在米尔斯坦实验室手中！而这种革命性的技术，往往不仅是他们个人的摇钱树，更可能成为威胁别国产业的扼喉钳。看起来，他们已经可以因此成为亿万富翁，而剑桥大学和大英帝国也将从他们的成果中大获其益。这种情况下，如果有人问我要不要放弃专利，我一定会觉得他是绝对的傻瓜。
但就是在这样的情况下，米尔斯坦实验室做出了惊世骇俗的抉择——放弃专利权，使得全世界的研究者和病人不需要支付额外的专利费用就可以享受使用单克隆抗体技术生产的试剂和药品。
能发明出这项技术，可称学术大牛；能顾及他人疾苦并捐出自己巨额财富中的金山一角，可谓慈善大家；而能够真正做到放弃这一技术专利来造福苍生，恐怕已经接近圣人了吧！区区「感谢」二字，放在这里，显得多么苍白无力！
一个人如何能做出这样的选择？我想，这和米尔斯坦的个人经历有关。
他见证着祖国阿根廷从繁荣的顶峰跌落——经历过过它的美好，眼看着它的动荡，悲切于它的倒塌。而他自己，纵有学富五车，又能做什么呢？他不能登上政坛指指点点，更不可能找到救国救民的办法；归根到底，他就是一个科学工作者罢了。最终背井离乡逃去敌国的他，想过要为大洋彼岸的祖国建设一流的学校，想过要为莘莘学子奉献自己的学术生涯，想过让自己的实验室在祖国的土地上开花结果，想过用自己一生的所学所见去振兴他童年时那个曾经繁花似锦的祖国。但当无形的大手摇动起命运的齿轮，将他一切的美好设想最终都碾为灰烬，吹散在大西洋的海风之中——他知道，在当时的阿根廷的国家命运面前，自己渺小无比，犹如天地一粟，自保尚不能够。蚍蜉难撼树，螳臂怎当车？
现在，一项关乎千万万亿万人民，全世界受压迫的、贫苦的、飘摇的人民命运的技术就在你的手中，你是要用它赚个盆满钵满，还是用它接济那些无助的双手？现在，当年的无力已经不复存在，已经功成名就，手握重大专利的你，是否还会想起自己的祖国，想起自己曾经可望不可及的梦想，和仓皇逃向英国的那个夜晚？这项技术，是属于全世界，还是属于你，和收养了你的祖国的仇敌？他用自己的行为做出了回答。
只有当世界上真正穷苦的人们也能平等地分享科学带来的好处时，科学才算是兑现了它的诺言。
—— 犹太裔阿根廷免疫学家，诺贝尔奖得主，剑桥大学蛋白质和核酸化学系主任
塞萨尔·米尔斯坦
———— 第一篇 完 ————
星号注释与扩展知识：
抗体-药物结合物（ADC）和肽-药物结合物（PDC）的靶向治疗通常由单克隆抗体或肽、有毒有效载荷和裂解/非裂解链接剂组成，已被广泛研究。与传统化疗相比，共轭物能够选择性地将细胞毒性有效载荷输送到靶细胞，从而提高疗效，降低系统毒性，并改善药代动力学（PK）/药效学（PD）。
Coons等人于1942年首次发表了免疫组织化学（IHC）技术的使用：他们使用荧光抗体来标志和观察肺炎链球菌(Coons,Creech and Jones,1941)。据考证，IHC到70年代后才开始应用于肿瘤学、病理诊断等方面，产生了重大影响。单克隆抗体问世的重要性不言而喻。
二氢叶酸还原酶(DHFR)使用NADPH作为电子供体，将二氢叶酸还原为四氢叶酸。氨基蝶呤(4-aminofolic acid)作为四氢叶酸类似物可以抑制二氢叶酸还原酶和胸苷酸合酶，阻止四氢叶酸分子给出亚甲基基团后再生，从而阻碍核苷酸合成。这一化合物尤其抑制胸腺嘧啶的合成，总体上对于DNA和RNA的合成起抑制作用，属于一种抗肿瘤药物。氨甲基蝶呤(甲氨蝶呤,MTX)也是叶酸类似物，与之作用相似。
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