2023.07.11人脂肪干细胞提取步骤

2023.7.12，下午17.30

乳腺科脂肪，患者51岁

使用的胶原酶：胶原酶Ⅰ型（品牌：yeasen，cat：40507ES60，LOT:C1309010），用α-MEM培养基配制1%的胶原酶，－20℃避光保存

 

取得标本后，冰上保存，尽快处理

用pbs+1%双抗在皿中剪碎，去除筋膜和血管（2遍）

装入50mlEP管，加入pbs+1%双抗，500转，5min（2遍，第2遍时将脂肪进一步剪碎成糊状）

获得约25ml脂肪

加入等体积的0.1%Ⅰ型胶原酶（即25ml）

37℃，摇床，150转速，消化2h

用等量完全培养基终止消化（即50ml）

1500转，15min离心

可见上层有未消化完的脂肪和黄色的油脂，用巴氏管吸除

下层液体重悬后，70um滤网过滤

获得的液体1500转，10min离心

弃上清，底部留5-10ml

加入培养基重悬，转移到15mlEP管中

1500转，5min离心

弃全部上清

加入5mlRBC裂解液，重悬

放入细胞培养箱孵育5min

取出，加入5mlpbs重悬

1200转，5min离心

可见底部沉淀已经变白（红细胞已经去除）

加入10ml培养基重悬

1200转，5min离心

弃全部上清

用培养基重悬后接种至6孔板

 

另贴壁法：脂肪组织清洗干净后，剪碎，组织块均匀地铺在培养皿中

尽量吸干净水分

培养箱放置2h后再加入α-MEM培养基（含20%FPS）

回顾：

1.消化时完全可以分2个管，本次用1个管（25ml脂肪+25ml胶原酶）比较拥挤，感觉摇床时震荡不充分

2.之前取得的乳腺科脂肪可能是取错位置了，一半都是筋膜，或者腺体，不像脂肪。本次样本明显大部分是脂肪，去筋膜和血管仅损失了1/5的体积

3.清洗后共30ml体积的脂肪，其中5ml用于贴壁法，6个100mm圆皿，剩余的25ml用于消化法，接种在6孔板的6个孔中

4.P0代全部用20%FPS的α-MEM培养