植物科研｜通过 MST 技术，实现无标记二元互作及竞争结合分析
稻瘟菌（M. oryzae）引起的稻瘟病是水稻生产上严重的真菌病害，每年造成高达 30% 的谷物减产，给我国农业生产造成巨大的经济损失。
为此，今天介绍 2 篇来自中科院微生物所刘俊课题组的科研成果：
1. 使用 MST 技术进行二元互作，揭示了水稻抗稻瘟病的新机制。
2. 借助 MST 技术完成竞争结合分析，探究了水稻针对稻瘟菌的免疫机制。
揭示水稻抗稻瘟病的新机制
Nature Communications
1. 研究背景
病原体感染通常会破坏宿主细胞，导致伤害相关的模式分子 (DAMPs) 产生，进而激活植物的免疫反应。稻瘟菌是否会导致水稻细胞壁释放 DAMPs 尚不清楚。
2. 研究解析
2021年4月发表在Nature Communications 上题为 "Poaceae-specific cell wall-derived oligosaccharides activate plant immunity via OsCERK1 during Magnaporthe oryzae infection in rice" 的研究成果，揭示了一个水稻抗稻瘟病的新机制。
研究人员通过对稻瘟菌侵染水稻时的转录组分析发现，稻瘟菌 GH12 家族基因 MoCel12A 及其同源基因 MoCel12B 在侵染早期表达量显著升高，并被分泌至水稻质外体。之后以水稻细胞壁中的半纤维为靶点进行降解，形成寡糖，而这些寡糖被水稻的免疫蛋白复合物 OsCERK1-OsCEBiP 感知，经信号转导激活免疫系统。
3. MST 技术应用
研究人员使用 MST 技术基于 OsCERK1 蛋白的内源荧光，检测到 OsCERK1 蛋白与三种特异性寡糖的亲和力分别是 1.95μM，2.9μM 和 8.38μM。在检测时无需对 OsCERK1 蛋白进行任何标记或固定处理，降低了样品处理影响检测结果的风险。
图示 : MST 检测显示 OsCERK1-ECD 与特异性寡糖结合
此外，寡糖的分子量很小（例 : BGTETB MW 为667D），若使用仅基于分子量变化的互作技术进行检测，可能会出现信噪较低的问题而检测不到结合。而 MST 技术不仅仅依赖于分子量变化，结合造成的电荷、水化层和构象等变化均可被灵敏检测到。
水稻针对稻瘟菌的免疫机制
The Plant Cell
1. 研究背景
植物免疫系统可以保护它们免受大多数病原体感染。植物使用特定的蛋白质（如受体）来识别病原体的保守特征，例如细胞壁成分等。一旦植物识别病原体，免疫系统就会开启。免疫系统对农作物尤为重要，因为它直接关系到我们的粮食安全。水稻是世界范围内种植的作物之一，但它们经常受到稻瘟菌的威胁，而稻瘟菌是如何干扰水稻免疫系统尚不清楚。
2. 研究解析
2019 年发表在 The Plant Cell 上题为 “Binding of the Magnaporthe oryzae Chitinase MoChia1 by a Rice Tetratricopeptide Repeat Protein Allows Free Chitin to Trigger Immune Responses”。研究人员鉴定出一种由稻瘟菌(M. oryzae) 分泌的几丁质酶 MoChia1（Magnaporthe oryzae chitinase 1），能够结合几丁质从而抑制植物免疫反应。通过 MST 技术，研究人员发现水稻中的四肽重复蛋白 OsTPR1 竞争性地结合 MoChia1，从而允许游离几丁质的积累并重新建立免疫应答。研究表明，水稻植物不仅可以识别 MoChia1，还可以使用 OsTPR 来抵消其几丁质酶的功能，从而恢复免疫。
3. MST 技术应用
图B：MoChia1与OsTPR1 亲和力检测，Kd=0.052μM
图C：
对于竞争结合分析，传统的 Pull down 实验操作复杂，且无法得到准确的定量信息。研究人员通过 MST 技术完成该三元复合体系的竞争结合检测，且无需任何标记或固定。MST 结果表明， MoChia1 与 OsTPR1 之间的亲和力高于 MoChia1 与几丁质的亲和力，OsTPR1 不与几丁质结合。将 MoChia1 和 20μM OsTPR1 孵育后，发现 MoChia1 与几丁质的亲和力降低了一个数量级 (Kd=1.34μM)。而在将 OsTPR1 浓度提高到 100μM 后，MoChia1 与几丁质间无结合。表明 OsTPR1 和几丁质竞争结合 MoChia1，从而释放几丁质，激活免疫反应。
以上两篇案例中的 MST 实验均通过 Monolith 仪器的 Label-Free 通道完成，该通道的激发光为 280nm，可直接通过蛋白的内源荧光检测亲和力，真正做到了无标记检测蛋白天然构象下的结合。
> 无需固定，不受检测样品种类的限制
> 仪器操作简单，无需繁琐的清洗维护
> 检测速度快、测量范围广 (Kd : 从pM到mM)
> 仅需微量样品，即可直接在溶液中测定分子间结合
参考文献：
1. Yang, C., Liu, R., Pang, J. et al. Poaceae-specific cell wall-derived oligosaccharides activate plant immunity via OsCERK1 during Magnaporthe oryzae infection in rice. Nat Commun 12, 2178 (2021). https://doi.org/10.1038/s41467-021-22456-x
2. Yang, C., Yu, Y., Huang, J., Meng, F., Pang, J., Zhao, Q., Islam, A., Xu, N., Tian, Y., and Liu, J. Binding of theMagnaporthe oryzaechitinase MoChia1 by a rice tetratricopeptide repeat protein allows free chitin to trigger immune responses.The Plant Cell, 2019, 31: 172–188
