CRISPR/Cas9技术解析（1）

Ø  RNAi技术瓶颈

目前，在基因干扰的方法中，应用最广泛的当属RNAi技术（siRNA or shRNA）了。对于研究者来说，暂时抑制或者下调基因功能，RNAi技术只需设计相应的siRNA转染进入细胞，操作简便，性价比高。然而，这种技术有很多潜在的问题：

 常见的脱靶效应你以为是你研究的基因，其实不是

如利用RNAi技术筛选的STK33基因作为癌细胞靶标而最后被证明是乌龙事件，siRNA靶向的是脱靶后的其他基因而非STK33基因，此类事例数不胜数，因此，结合CRISPR/Cas9技术，结果可能会更准确。

目的蛋白表达水平下调不明显

很多研究者在设计siRNA时，会多设计几条siRNA序列，转染后筛选最佳的siRNA，然而，即便这样，可能目的基因和目的蛋白表达水平下调不明显。除此以外，还有高转化率的转录本和非编码基因难以被干扰等，给研究造成了一定的困难。

Ø  CRISPR/Cas9技术的诞生

但是，科学总在不断进步。2020年诺贝尔化学奖首次同时授予2名女性科学家。她们分别是基因编辑技术CRISPR/Cas9的发明者：法国和美国科学家埃曼纽尔·卡彭蒂耶（Emmanuelle Charpentier）和詹妮弗·杜德纳（Jennifer Doudna）。CRISPR/Cas9，是她的英文Clustered Regularly Short Palindromic Repeat的缩写，这个成簇规律间隔短回文重复序列最初是在细菌中被发现的，名字听起来很高大上，但其实很简单：它的本质上就是在很多细菌基因组DNA上总会出现重复多次的DNA序列，重复序列之间夹杂着看似无序的序列，后来，结果对比发现，看似无序的序列和很多病毒基因组高度一致。进一步，研究者们发现，原来，细菌在面对病毒入侵以后，活下来的细菌会把病毒基因组的一部分DNA小心的储存在这段精心设计的重复序列里面，当下次面对同种病毒再次入侵时，细菌会快速识别病毒，并将病毒DNA剪切从而失去功能，阻止对细菌本身的伤害。不同于人类这种多细
胞生物本身存在多种免疫细胞，单细胞的细菌的免疫系统显得简洁优美。

那么，细菌是如何发挥它的免疫功能，识别病毒的DNA序列呢？科学家发现，CRISPR序列可以转录成RNA分子，并和细菌内某种蛋白结合（Cas类蛋白），形成CRISPR/Cas结构（以Cas9蛋白为例），这类CRISPR/Cas每日在细菌细胞内巡逻，寻找是否有和它完美匹配的DNA分子，显然，能匹配的序列只能是入侵的病毒。一旦两者相遇，病毒和Cas9蛋白上的RNA互补配对，被Cas9蛋白抓住，然后Cas9蛋白发挥相应的核酸酶功能，剪断病毒的DNA，使其失去功能。

这一段精彩的故事暂时看起来和基因编辑毫无关联，但是，请思考一下，这套系统有一个巨大的作用：识别目标序列并进行剪切。假如我们把细菌转录的RNA换成可以和我们目的基因结合的RNA（sgRNA）呢？一方面，sgRNA可以和Cas9蛋白结合，另一方面，sgRNA可携带着Cas9蛋白精确找到靶基因，并对其进行一系列剪切，使此基因彻底失去功能。因此，新一代的基因编辑技术CRISPR/Cas9诞生了。