药物发现中的数据质量：分析性能在配体结合测定中的作用
引言
准确的结合常数对于优化药物开发中的先导化合物、疗效和选择性至关重要。它们是结构-活性关系（SAR）和预测新化合物结合的计算模型的基础。不同的检测方法、结合位点和环境会产生变异，因此必须谨慎比较数据。然而，目前参数的准确度和精确度都不高，平均偏差为 0.5 对数单位，潜在差异超过 300 倍。这与制药质量控制规范形成了鲜明对比，凸显了提高结合常数数据质量的必要性。
对实验 Ki 数据不确定性的研究包括比较 ChEMBL 数据库中 2540 个蛋白质配体系统的 7667 个独立测量值。图中显示了所有配对的 pKi 值，2.5 pKi 单位的阈值表示一个数据集中允许的最大偏差。超出该阈值的偏差突出了需要改进的地方。数据质量直接影响预测的精确度和可靠性。例如，测量结合事件的 ∆G 值，尤其是 ∆S 值的估算，就需要很高的数据质量。图 2 展示了实验室内分析方法随时间变化的情况，突出了精确测量的重要性。
单个实验室的分析方法随时间变化的一个说明性例子涉及 PDE4D 的罗利普仑和 PDE3 的西洛他胺的 IC50 值测量。测定条件和溶液处理方法的变化会产生变异。罗利普仑/PDE4D 和西洛他胺/PDE3 的对数 IC50 值的标准偏差分别为 σ = 0.22 和 σ = 0.17（改编自 Kalliokoski 等人 [3]）。这显示了分析波动对测量值的影响。
分析性能包括准确度、精确度、选择性和速度，不仅对分析人员，而且对生成数据集的下游用户都非常重要。它为数据质量评估、实验设计和合作选择提供指导。为加深理解，这篇文章概述了相关检测方法的基本原理和功能原理，并提供了性能信息汇编。
为可靠的结合常数测量选择正确的检测方法
生化分析--免疫分析*
免疫测定（如 ELISA）对定量生物大分子很有价值。
酶联免疫吸附试验方案不断发展，以实现高精确度和数据质量。
必须控制关键参数，如样品稀释顺序。
免疫测定的验证和质量评估至关重要。
表面等离子共振（SPR）检测基于 SPR 的检测方法可实时测量分子间的相互作用，适用于各种应用。
SPR 的优势包括测量较低的结合亲和力和实时结果。
考虑配体量和稳定性，以便与传感器芯片有效共价结合。
稳健性、维护和基质会影响 SPR 检测的可变性。
基于荧光的配体结合检测基于荧光的检测对于 GPCR 研究和配体结合非常重要。
批量结合、发射光谱分析和 FRET 等各种技术都能测量荧光强度。
面临的挑战包括荧光团改变配体特性以及可能出现错误结果。
要区分结合/未结合配体、非特异性结合和基质效应。
等温滴定量热法
焓驱动优化有利于平衡药物化合物。
ITC 将结合自由能 (ΔG)分解为焓 (ΔH) 和熵 (ΔS)。
直接测量 ΔH、结合常数 KD 和化学计量学。
热力学分析的黄金标准。
需要精确的配体和蛋白质浓度。
配体和蛋白质缓冲液应匹配。
结合等温线的形状影响可靠性；c 值应在合适的范围内。
正确的实验设计和对照实验至关重要。
配体和蛋白质溶解度的限制会影响测量范围。
反滴定或基于竞争的实验可以克服这些限制。
核磁共振
用于配体结合和结构确定。
基于靶标的方法使用化学位移扰动（CSP）。
基于配体的方法包括转移 NOE（trNOE）、STD、waterLOGSY 等。
灵敏度和信号增强技术非常重要。
配体浓度会影响灵敏度和信号质量。
CSP 可用于确定结合亲和力和表位。
可使用适当的方法量化结合亲和力。
可使用市售标准培养基。
应使用深冻培养物和参考细胞。
应仔细验证准确度和精密度。
亲和毛细管电泳
适用于研究涉及电荷变化的相互作用。
适用于较弱的相互作用（KD 超过 10-6 M）。
样品量少，实验时间短。
非常适合早期发现阶段。
基于细胞的检测
复杂的生物相关信息。
考虑细胞系、培养基和标本年龄。
建议进行对照实验和商业测试。
仪器性能鉴定和验证至关重要。
应确定特异性、灵敏度、线性度和量程。
精度和变异性取决于实验室、人员和条件。
实验室间比较需要标准协议和验证。
取得进展所需的参数和监管验收核对表。
因有望获得更多相关生物数据而关注进展。
检测方法的一般比较
速度：
SPR、免疫测定、荧光测定、无线电配体结合测定。
ACE、MST 和 SPR 可通过多路复用加速。
精确度（KD）：
免疫测定、荧光测定、核磁共振、SPR 和 ACE 可达到 2-10% 的 RSD。
空间信息：
核磁共振（SAR by）、X 射线晶体学。
低样品量：
免疫测定、荧光测定、ACE、SPR、MST。
亲和力范围：
极强亲和力（<10^-9）：免疫测定、荧光测定、无线电配体结合测定、SPR、NMR。
低亲和力（>10^-3）：SPR、NMR、ACE、MST、荧光检测。
特异性：
核磁共振、免疫测定、荧光测定、无线电配体结合测定。
准确性确认：
使用其他方法确认结合数据可确保准确性。
优化检测：提高性能和精度的策略
需要优化的参数：
选择检测方法时需要考虑与生物系统的相关性、亲和力范围、速度、稳健性、选择性、准确性和精密度等参数。这些参数对于在规范环境中进行检测优化和质量保证至关重要。
时间要求和精度
高速检测对于高通量系统和快速方法开发至关重要。精度可通过增加重复次数来提高。速度可以换取精度，复用和片上实验室等先进技术可以提高分析速度。
避免常见的误差源
随机误差（数据分散）和系统误差（偏差）都会造成总误差。造成误差的因素包括不完整的标准操作程序（SOP）、实验参数的不可控变化、样品制备假象、溶剂偏差以及聚集和吸附等现象。
优化化验精度：降低方差成分
主要误差源在总误差中占主导地位。减少常见误差源可大幅降低总误差。需要通过彻底调查和对照实验来确定和了解可能影响误差的未知相关参数。
分析经验和理解
通过分析经验、观察和仔细调查，确定并了解特定技术的相关参数。控制实验的控制图有助于确定趋势和误差来源。
参数分析的实验设计
使用实验设计方法，如 Plackett-Burman、分数因子和中心复合设计，分析有影响的参数及其对总误差的影响。这种循序渐进的方法有助于提高精度和了解误差的贡献。
化验优化的结论和未来展望
识别并解决主要错误源至关重要。循序渐进的改进可以显著提高检测性能，从而推动药物发现。像 ICSH/ICCS 工作组这样的合作努力有助于取得进展。配体结合测定的比较引发了争论，众说纷纭。尽管挑战依然存在，但持续的讨论和改进工作有可能显著提高数据质量，推进药物发现过程。我们鼓励合作讨论和分享见解，以取得进一步的进展。
参考资料：Wätzig, H., Oltmann-Norden, I., Steinicke, F. et al. Data quality in drug discovery: the role of analytical performance in ligand binding assays. J Comput Aided Mol Des 29, 847–865 (2015). https://doi.org/10.1007/s10822-015-9851-6
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