技术干货丨单细胞技术在植物领域的应用进展
单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）开创了以细胞为基础的转录组分析的新时代。毫不夸张地说，scRNA-seq 的出现正在彻底改变从组织到细胞的整个转录组的细节。有了这项颠覆性的技术，现在可以前所未有地挖掘组织类型之间和细胞内的异质性。这使得能够更快速地识别稀有和发现新的细胞类型，同时表征多种不同的细胞类型和状态，更准确、更完整地了解它们在生命过程中的作用。单细胞测序技术在医学领域研究中已有广泛应用，并逐渐在动植物研究中展开应用。越来越多从事植物研究的科研工作者已经利用单细胞/空间转录组技术进行组织异质性、发育、抗逆、以及育种等方面的研究，解决了众多动植物领域的重要科学问题。然而，在植物方向的单细胞组学应用上依然存在一些难题，接下来我们一起来了解一下~
难点一：原生质体的制备无法形成通用的原生质体制备方法
对于植物来说，单细胞实验在收集细胞之前，需要通过酶消化去除细胞壁（原生质体制备）。而植物原生质体制备存在以下几个难点：
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植物细胞被固定在刚性细胞壁基质中，分离单细胞时需要将其去除；
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植物细胞壁的酶消化是一种重要的胁迫源，容易刺激植物细胞出现应激反应，诱导压力应答基因的表达，人为引入转录偏差；
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植物原生质体大小存在可变性（渗透压导致的原生质体胀大，甚至破裂影响后续实验）；
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质体细胞器和液泡中存在可与 RNA 相互作用的次级代谢物导致表达量检测不准确；
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不同组织类型间适用的酶组合不同，需要优化消化细胞壁所需的酶；
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制备的原生质体很脆弱，活性波动大。
难点二：部分物种已知 Maker 基因较少不能准确鉴定细胞类型
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没有任何的研究基础的物种，可以根据切片显微镜观察横断面结果进行细胞注释（Wang Q et al., 2022）；
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有少量研究基础，这种情况可以做切片来进一步观察组织结构，利用这个结果不仅可以验证前人的研究结果，还可以有新发现；或者将前人的研究基础和研究目的结合，只注释感兴趣和后续研究的细胞类型；
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研究基础比较多的情况，这种可以 Marker 基因来进行注释，同时也可利用与特定组织部位的 bulk 转录组数据进行比对从而对单细胞数据进行分群鉴定。
难点三：部分物种无参考基因组
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单细胞转录组数据分析时需要将 reads 比对到参考基因组，然后再使用定量软件进行定量，无参考基因组则无法完成基因定性定量；
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其次，在进行注释时也需要根据基因表达情况辅助进行；无参考基因组也会为注释工作带来一定限制。
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目前，博奥晶典已积累丰富的项目经验，针对不同物种的多种组织类型开发了特有的解离方法，已成功完成了拟南芥、水稻、烟草、荆芥、油菜、白菜、橄榄、苜蓿、苹果、梨、菠菜等多物种多部位的原生质体制备。其次，对于比较难制备原生质体的物种博奥晶典推出植物单细胞核转录组技术来解决此难题，它的出现为植物单细胞研究提供了更多可能。
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细胞注释方面，博奥晶典自主搭建了 SingleCellBase 细胞注释数据库，该数据库整合 2000+ 篇高分单细胞文献数据，纳入了多个物种（包括鱼、鸡、猴子、猪、拟南芥等 33 个物种）和组织的细胞类型 Markers，实现了各类物种各类组织的细胞类型精准注释。
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对于无参考基因组的物种有以下几种解决方案：1、组装一个基因组再进行后学分析，但这种方式难度较大、成本较高，而且时间较长；2、使用三代全长转录组技术构建参考转录本，然后直接将单细胞转录组测序数据与参考转录本比对。
植物单细胞测序的应用潜力不言而喻，那植物单细胞测序到底能解决哪些科学问题呢？
构建细胞图谱及鉴定稀有细胞
构建细胞动态发育轨迹
研究不同转录因子调控网络
探索胁迫对不同细胞类型的响应
支持发表案例分享
案例1：Differentiation trajectories and biofunctions of symbiotic and un-symbiotic fate cells in root nodules of Medicago truncatula
【发表期刊】Molecular Plant
【发表时间】2022年
【研究方向】苜蓿根瘤图谱绘制
中国农业大学王涛教授、董江丽教授团队在 Molecular Plant 上发表了苜蓿根瘤的研究论文。该团队攻克了分离根瘤单细胞的技术难关，报道了以截形苜蓿为代表的不定型根瘤单细胞转录组图谱，揭示了成熟的不定型根瘤中不同转录表达模式的细胞类群，以及共生细胞类型和非共生细胞类型的分化轨迹和生物学功能，发现了共生固氮新机制：固氮细胞将氮同化为谷氨酰胺，非固氮细胞将谷氨酰胺转化为天冬酰胺供植物生长发育的新机制。
案例2：Single-cell transcriptome reveals differentiation between adaxial and abaxial mesophyll cells in Brassica rapa
【发表期刊】Plant Biotechnology Journal
【发表时间】2022年
【研究方向】大白菜腹面和背面叶肉细胞的分化
2022年9月, Plant Biotechnology Journal 在线发表了中国农业科学院蔬菜花卉研究所蔬菜分子设计育种团队关于大白菜背腹面叶肉细胞的分化的论文。该研究通过对白菜叶片进行单细胞测序结合改良的 tape-sandwich 方法以及 RNA 原位杂交，区分了叶片栅栏组织和海绵组织，并鉴定了它们在单细胞水平的差异，揭示了腹面叶肉细胞和背面叶肉细胞的分化是大白菜叶球形成机制研究的一个重要进展。
截止2023年5月，博奥晶典已助力研究人员发表 5 篇植物领域新成果，影响因子超 63 分。
2023年5月12日，博奥晶典邀请以上两篇文章的通讯作者齐聚北京，共同参加“博奥晶典首届动植物单细胞时空技术高端应用研讨会”探讨动植物领域的最新应用与进展。下面跟随小编的脚步再回顾一下会议的精彩瞬间。
大会精彩回顾
5月12日由北京博奥晶典生物技术有限公司主办的“博奥晶典首届动植物单细胞时空技术高端应用研讨会”在北京成功举办，议邀请 8 位动植物单细胞领域权威专家，围绕细胞共生与分化、发育及代谢调控、抗病抗逆机制研究等领域的应用进行了分享和深度探讨，现场气氛热烈。现场近 200 位动植物领域单细胞及空间组学研究学者、师生亲临现场，座无虚席，共同探讨单细胞时空组学技术在动植物领域的应用进展。
董教授首先介绍了氮素是植物生长发育必需的大量营养元素，生物固氮是自然界生物可用氮的最大天然来源。豆科植物与根瘤菌可以相互作用形成共生根瘤。然而，根瘤细胞的分化和联系在很大程度上仍然是未知的。该团队与博奥晶典共同建立了一个改良的根瘤原生质体制备方案，攻克了制备根瘤单细胞原生质体悬液的技术难关。通过对蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）接种根瘤菌 14 天生长的根瘤进行单细胞转录组测序，揭示了成熟的不定型根瘤中不同转录表达模式的细胞类群，以及共生细胞类型和非共生细胞类型的拟时序分析和生物学功能，发现了共生固氮新机制：固氮细胞将氮同化为谷氨酰胺，非固氮细胞将谷氨酰胺转化为天冬酰胺供植物生长。王教授团队的研究结果为研究根瘤器官形成和共生固氮的机制提供了重要资源。
王老师首先介绍了使用单细胞转录组测序技术探索大白菜叶片单细胞的异质性的研究过程，在单细胞水平探索叶片栅栏组织和海绵组织细胞之间的分化，并确定其关键的调控基因，对于揭示白菜类蔬菜作物叶片发育和叶球形成的机制是十分重要的。该研究使用莲座期大白菜的幼叶（n=3）进行单细胞转录组测序，构建了白菜莲座期幼嫩叶片的单细胞转录图谱。研究不仅成功区分了叶肉细胞中的栅栏细胞和海绵细胞，还发现了栅栏细胞是光合作用的主要细胞，海绵细胞主要是为栅栏细胞的光合作用提供支撑作用。他们还发现表皮细胞中背腹性基因表现出互斥的表达模式，在对白菜叶片维管系统不同细胞进行了详细的分类的同时解析了维管系统的发育路径口。研究表明单细胞转录组有助于理解和深入解析重要性状基因功能。
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参考文献：
1. Wang Q, Wu Y, Peng A, et al. Single‐cell transcriptome atlas reveals developmental trajectories and a novel metabolic pathway of catechin esters in tea leaves[J]. Plant Biotechnology Journal, 2022, 20(11): 2089-2106.
2. Ye Q, Zhu F, Sun F, et al. Differentiation trajectories and biofunctions of symbiotic and un-symbiotic fate cells in root nodules of Medicago truncatula[J]. Molecular Plant, 2022, 15(12): 1852-1867.
3. Guo X, Liang J, Lin R, et al. Single-cell transcriptome reveals differentiation between adaxial and abaxial mesophyll cells in Brassica rapa[J]. Plant Biotechnology Journal, 2022, 20(12): 2233-2235.
