文献信息：

• 题目：Genome-Wide Association Transethnic Meta-Analyses Identifies Novel Associations Regulating Coagulation Factor VIII and von Willebrand Factor Plasma Levels

• 杂志：Circulation

• 影响因子：37.8/Q1

• 发表时间：2019年1月

研究背景：

因子VIII (Factor VIII,FVIII)及其载体蛋白血管性血友病因子(von Willebrand Factor,VWF)调节止血和血栓形成，血浆中这些因子的较高水平与动脉和静脉血栓形成的风险相关，而较低水平与出血性疾病有关，并降低血栓形成事件的风险。严重的FVIII和VWF缺乏分别导致出血性疾病血友病A和血管性血友病。虽然目前尚不清楚FVIII和VWF水平是否与血栓性疾病的风险有因果关系，但一些遗传和观察证据表明，这些蛋白对血栓性疾病有影响。本研究的目的是通过扩大先前全基因组关联研究(genome-wide association stuidies,GWASs)中发现样本的大小和祖先多样性，以及通过使用1000个基因组估算数据和纳入X染色体变异来提高基因组的覆盖率，从而确定影响FVIII和VWF血浆水平的新的遗传关联。对于具有全基因组意义的发现，本文对候选基因座进行了第一次功能表征，以提供额外的关联证据，并更好地了解这些凝血表型的血浆水平调节生物学。最后，通过应用本文的遗传发现作为工具变量，使用孟德尔随机化(Mendelian randomization,MR)分析表征了血浆FVIII和VWF水平对临床心血管事件的因果关系。

研究方法：

由于患者保密协议和遵守研究参与者的同意，原始数据和研究材料不能提供给其他研究人员用于重复结果或重复过程。分析方法将根据要求提供，摘要统计数据已通过美国国家医学图书馆的国家生物技术信息中心基因型和表型数据库(dbGaP)公开提供。

该项目由CHARGE联盟(基因组流行病学心脏与衰老研究队列)止血工作组组织。分析了来自9项FVIII水平研究的32610例个体和来自18项VWF水平研究的46354例个体的低频和常见(次要等位基因频率[MAF] >0.01)变异的表型-基因型相关性。共有20项研究对其中一项或两项分析都有贡献，其中包括欧洲、非洲、东亚和西班牙裔的参与者。参与队列的描述和血统组成见在线数据补充表1。所有的研究都得到了适当的机构审查委员会的批准，所有的参与者都为他们自己和他们的未成年子女提供了使用他们DNA的书面知情同意书。

1、基因型收集与质量控制：

所有参与者使用Illumina或Affymetrix提供的商业基因分型平台进行基因分型。每项研究都进行了基因分型质量控制检查，并使用可用的代入方法为每个参与者代入了1000个基因组群体第1阶段第3版中描述的约3500万个常染色体和x染色体多态性变异每个队列的变量呼叫和质量控制程序在附录中详细描述。

2、统计分析：

血浆FVIII或VWF水平(或活动水平)高于或低于人群平均水平3个标准差(SDs)的参与者被剔除，接受抗凝治疗的个体也被剔除。在每项研究中分别分析天然对数转化FVIII活性和VWF抗原水平(百分比或国际单位每毫升x 100)。使用遗传加性模型对输入的变异剂量和表型水平进行研究特异性回归分析，并使用主成分调整性别、年龄、研究设计变量和种群亚结构。所有分析均按祖先分层，然后进行荟萃分析。x染色体变异另外按性别分层，男性受试者的剂量值编码为0/2。

特定研究结果集中上传，并在使用EasyQC软件包进行meta分析之前对所有个体研究进行质量控制β或标准误差值>5或imputation值<0.3的变异被排除在分析之外。对所有单核苷酸多态性(SNPs)计算的估计次要等位基因计数是等位基因频率、每个队列样本总数和代入质量的函数;<10的值被排除在分析之外。根据1000 Genomes phase 1 version 3参考面板对等位基因进行协调，排除重复snp或与参考不一致的snp。

使用固定效应倒方差加权方法对每个祖先群体进行meta分析，然后使用相同的方法进行跨种族分析跨种族分析作为发现结果呈现，使用特定于祖先的分析来告知和解释这些信号。在P<2.5×10−8时，认为全基因组的关联具有统计学意义，以纠正未包括在初始一代GWASs中的低频变异，并且仅报道了至少3个队列中通过质量控制的变异。荟萃分析后，MAF <1%的变异被过滤掉。计算每个发现队列的基因组控制系数，并用于校正隐型亲缘关系。最后，将一个位点定义为距离P值最低的SNP±1 Mb，并选择P值最低的SNP代表该位点。

3、基因沉默对候选基因座进行功能鉴定：

在没有复制队列的情况下，对候选基因座进行了第一次功能表征，以提供额外的关联证据。对于每个全基因组显著位点，选择了可能负责观察到的关联的候选基因。选择基于与每个区域中最相关的snp的接近程度，公共数据库中关于snp在调节附近基因的表达和功能方面的推测作用的信息，以及调节VWF/FVIII的假设生物学机制。这个选择过程为每个相关位点确定了1到3个候选基因。为了筛选功能，将人脐静脉内皮细胞(Life Line Cell Technology)镀在胶原包被的96孔板上，并用小干扰RNA (siRNA)转染siRNA (Silencer Select, Thermo Fisher Scientific)，使用转染试剂oligofectamine (Thermo Fisher Scientific)靶向候选基因。细胞转染后培养4天，然后将培养基替换为对照培养基或含有10µmol/L组胺的培养基30分钟，以刺激炎症反应。采用Fitzgerald Industries公司的抗体，采用ELISA法测定培养基中的FVIII和VWF, FVIII的检测范围为0.003 ~ 0.21 IU/mL, VWF的检测范围为0.5 ~ 120 ng/μL。每个实验重复4次，结果以与阴性对照(转染scramble siRNA)相对表达量的平均值±SD表示。

主要结果：

1、FVIII、VWF和多表型Meta分析

用于FVIII Meta分析的数据取自25897名欧洲血统、4500名非洲血统、773名东亚或印度裔亚裔血统和1440名西班牙裔参与者，共计13887196个变体通过了所有筛选，并确定了1431个在11个位点达到全基因组统计显著性的变体。VWF的数据取自42379名欧洲血统、3700名非洲血统和275名西班牙裔参与者，共计10537485个变体通过所有筛选，并在17个基因座上鉴定出2453个全基因组显著变体（图1A和1B）。

表1展示了FVIII、VWF和FVIII-VWF组合表型的遗传发现结果。总共鉴定出23个独特的基因位点，其中13个是以前未报道的新关联。在新发现的位点中，7个与FVIII水平相关(FCHO2/ TMEM171/TNPO1、HLA、SOX17/RP1、LINC00583/NFIB、RAB5C/KAT2A、RPL3/TAB1/SYNGR1/PDGB、ARSA)， 11个与VWF水平相关(PDHB/PXK/ KCTD6、SLC39A8、FCHO2/TMEM171/TNPO1、HLA、GIMAP7/GIMAP4、OR13C5/NIPSNAP、DAB2IP、C2CD4B、RAB5C/KAT2A、RPL3/TAB1/SYNGR1/PDGB和ARSA)。

2、功能分析：

本文抑制了12个基因座中的21个基因，以评估对体外FVIII和VWF分泌的影响(图2A和2B)，其中包括接近确定的主要候选基因(表1)。结果表明，在基础或组胺刺激条件下，12个候选基因位点中有10个基因位点至少具有1个改变培养基中VWF水平的基因。

具体而言，在基础条件下，y抑制PDHB、SLC39A8、TMEM171、TNPO1、HLAC、GIMAP7、NIPSNAP3A、NIPSNAP3B、C2CD4B和SYNGR1增加了VWF的释放，而抑制ST3GAL4则减少了VWF的分泌。

当细胞受到组胺刺激时，y抑制TMEM171、TNPO1、HLA-C、SNIPSNAP3A(但不包括SNIPSNAP3B)、C2CD4B、KAT2A和TAB1增加了培养基中的VWF释放，抑制RAB5C则减少了VWF分泌(表1和图2A和2B)。对于仅与FVIII水平相关的5个基因(LINC00583、NFIB、SOX17、RP1和TMLHE-F8)的实验无法在处理过的人脐静脉内皮细胞培养基中检测到FVIII水平，因此，实验结果不确定。

表2 条件分析后所有相关独立变量的特征

研究结论：

本文发现了13个新的基因位点，它们对血浆FVIII或VWF水平的有着一定程度的影响。本文的发现方法包括首次功能验证，为新位点的最佳候选基因提供了相关信息。最后，MR分析提供了一些证据，表明FVIII血浆水平与冠心病和静脉血栓栓塞的风险有关，VWF血浆水平与IS的风险有关。总之，本文的工作已经确定了新的基因座，调节止血和凝血所必需的蛋白质。这些发现可能为治疗和预防策略提供遗传工具，并可能有助于确定新的生物途径，通过这些途径进行干预，以减少动脉和静脉结果的负担。

1、创新点：

样本量相对较大，并且使用了比以往更密集的样本来源，通过这种方法，可以鉴定出不常见的相关变异，但是新相关位点中变异的MAF相对常见，只有1个变异的MAF <0.10。研究设计没有发现以罕见变异为标志的新关联。增加研究参与者的数量以增加统计能力或提高基因分型阵列的输入质量可能有助于识别与结果相关的不常见或罕见变异。

2、局限性：

需要通过复制来验证遗传关联，特别是那些接近统计显著性阈值的关联。为了弥补这一局限性，通过y抑制候选基因和测量VWF释放来进行功能验证，而这项功能性工作也是本研究的一个创新点。

另外，只能测试VWF表达的调节，而不能测试巨噬细胞对VWF清除的调节忽略了需要一种特定的细胞刺激，这种细胞刺激不能被组胺刺激所模仿。最后，可能是一些遗传关联的影响只能通过过度表达而不是基因抑制来观察。也尝试测量FVIII释放，但水平太低，因此需要新的模型来验证候选基因对FVIII水平的影响，这是方法的局限性。

所有的功能工作都是在体外完成的，这与体内研究相比有局限性。FVIII和VWF水平的强遗传协调控能够进行多表型分析，并增加发现的统计能力。