Part 3 间充质干细胞来源的外泌体与心肌梗死

考虑到患者数量及预后情况，急性心肌梗死后的治疗是心血管研究领域长期关注的重点。刺激血管生成、促进心肌再生和预防左心室功能障碍的治疗急性心肌梗死的新方法备受追捧。在过去的十年中，相当大一部分关注心脏再生的临床研究都集中在细胞疗法上，涉及到细胞（如间充质干细胞[MSCs]、心肌祖细胞[CPCs]）的植入，但益处不及预期。MSC即骨髓间充质干细胞。其特性的最低标准：

①   在标准培养条件下保持可塑；

②   表达CD105、CD73和CD90；

③   不表达(阴性标记)CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR表面分子；不表达(阴性标记)CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR表面分子；不表达(阴性标记)CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79a、CD19和HLA-DR表面分子；不表达CD105、CD73和CD90；

④   在生长因子刺激下体外可分化为成骨细胞、脂肪细胞和软骨母细胞；

⑤   具有自我可再生、多潜能、易于获取和体外培养可扩展的特性。

体内外研究表明，MSC可以分化为心肌细胞、内皮细胞（ECs）和血管平滑肌细胞(VSMCs)。然而，MSC注射在受者心脏中的植入率和存活率一直较低，移植后细胞数量迅速下降，这表明在MSC治疗后观察到的梗死面积的缩小不太可能是由于细胞的直接分化和修复。

大量证据表明，观察到的与细胞治疗相关的效应归因于注射细胞的旁分泌活性，而不是它们成功地整合/转分化到心肌中。MSCs、胚胎干细胞、CPCs和诱导多能干细胞(iPSCs)通过这种旁分泌信号活动介导心脏重塑。EV特别是外泌体是保护心肌细胞和促进再生的首要旁分泌因子。

另一方面，MSC来源的外泌体(MSC-Exos)已经被强调为有效的旁分泌载体，可以减少心肌梗死损伤和恢复心功能。

一、MSC-Exos的促血管生成作用

在体外观察到了MSC-Exos显著的促血管生成作用。同时，表达分析显示，在MSC-Exos治疗后，许多促血管生成因子和血管生成相关因子在不同的心肌细胞中显著上调。

MSC-Exos可使血管内皮生长因子(VEGF)在ECs中显著上调，它是维持血管内稳态和刺激血管生成级联反应的重要成分。有研究发现，MSC-Exos诱导的内皮细胞血管生成依赖于NF-κB信号通路，且呈剂量依赖性。暴露在缺血条件下的MSC-Exos大量表达与典型的血管生成相关通路有关的因子，如钙粘附素、表皮生长因子受体(EGFR)、成纤维细胞生长因子(FGF)和血小板衍生生长因子(PDGF)通路。低氧状态脂肪组织来源的[adipose tissue-derived, AD-]MSC-Exo治疗可促进内皮细胞促血管生成的基因的表达（例如Angpt1，Flk1），同时下调抗血管生成的基因（例如Vash1，TSP1)，这些表达变化是由靶细胞蛋白激酶A(PKA)信号通路的激活引起的。

蛋白质组学研究证明了上述促血管生成反应是由生物活性因子，如基质金属蛋白酶-9(MMP-9)、VEGF、细胞外基质金属蛋白酶诱导物(EMMPRIN，它介导MMPs和VEGF上游的细胞迁移和血管生成)在MSCs和ECs细胞之间的持续转移所介导的假设。

MSC-Exos还能够通过直接的miRNA转移来传递它们的促血管生成信号。在MSC-Exos中，促血管生成的miR-21、miR-1246、miR-23a-3p和miR-23水平很高。随后发现，在MSC-Exos处理的ECs中，一组血管生成相关基因上调，包括血管生成素网络成员(Angpt1、Angpt4和Angptl4)以及其他重要的血管生成介导物(肾上腺素B受体2[EPHB2]和神经粘连蛋白2[NRP2])。此外，许多与VEGF相关或增加其表达的基因，如MYC相关的锌指蛋白(MAZ)、信号素5B(SEMA5B)和核受体辅活化子1(NCOA1)也显著上调。相反，丝氨酸蛋白酶抑制剂Kazal-type 5(SPINK5)、花生四烯酸5-脂氧合酶(ALOX5)和蛋白磷酸酶1A(PPM1A)等几个抗血管生成基因在MSC-Exo处理的ECs中显著下调。而缺氧诱导的MSC-Exos含更多促血管生成的miR-125b-5p以及miR-21-5p（后者导致TGF-β信号通路、促血管生成的VEGF-α、血管紧张素转换酶-1、肥大性心钠素和脑钠素的表达增加）。

【总结】MSC-Exos中具有调节血管生成过程潜能的分子“货物”有：①蛋白类：钙粘蛋白；EGFR；MMP-9；VEGF；EMMPRIN；FGR；IL-8；PDGF；PDGFR；NF-κB；p195；TGF-β；②核酸类：miR-125b-5p；miR-21；miR-1246；miR-23a-3p；miR-23；miR-21-5p。

MSC-Exos也可以使心肌细胞中VEGF、血管生成成纤维细胞生长因子-β(FGF-β)和肝细胞生长因子(HGF)的水平显著升高（特别是AD-MSC-Exos作用最为显著）。

二、MSC-Exos的减少细胞凋亡作用

细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种形式，其特征是细胞膜起泡、细胞皱缩、染色质凝集和DNA片段化，随后会迅速被邻近细胞吞噬。它与坏死的区别在于没有相关的炎症反应。细胞凋亡在急性心肌梗死和再灌注引起的组织损伤中起着重要作用，导致心肌丢失，最终表现为心力衰竭。MSC-Exos可抑制缺氧诱导的细胞凋亡，起到保护心肌细胞作用，进而保护心室结构和心功能。

MSC-Exos的治疗作用至少部分是通过恢复靶心肌细胞的生物能量学来实现的。它治疗小鼠心肌可提高ATP和NADH水平，降低氧化应激，并增强缺血-再灌注损伤(I/R)心脏的促存活信号PI3K/AKT（磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B）的激活。同时，MSC-Exo处理降低了c-JNK（c-Jun氨基末端激酶)的磷酸化，c-JNK是促凋亡信号的主要激活剂。虽然潜在的抗凋亡分子机制尚不清楚，但推测MSC-Exos提供了一组在I/R损伤过程中丢失的氧化酶。

PI3K/AKT通路：是调控细胞凋亡和存活的关键细胞内信号转导通路。AKT是PI3K信号通路下游的主要蛋白效应物，通过调节胰岛素的生物学功能在葡萄糖代谢中发挥重要作用（高血糖时AKT信号通路的故障会增加心肌细胞的凋亡，同时伴随着细胞色素c从线粒体释放的增加和caspase-3活性的增强）。该途径受磷酸酶和张力蛋白同源物(PTEN)通过其磷酸酶去磷酸化活性的严格调控。在调控PI3K/AKT通路的MSC-Exo抗凋亡miRNAs中，高度富含miR-144的骨髓MSC（BMSC）-Exos通过与PTEN/PI3K/AKT相互作用显著拮抗缺氧心肌细胞的凋亡。

MSC-Exos治疗激活AMPK/mTOR和AKT/mTOR信号，通过增强自噬部分减少体外和体内的细胞凋亡。PI3K/AKT激活可能通过加速自噬信号通路参与上述抗凋亡反应。

此外，AD-MSC-Exos通过Wnt/β-catenin通路调节来对抗细胞凋亡，Wnt/Wnt-catenin通路是心肌细胞存活的关键调节因子。

Wnt信号通路是一个复杂的调控网络，目前认为它包括三个分支：

➤ 经典Wnt信号通路，通过β-Catenin激活基因转录；

当细胞没有接受Wnt信号刺激时，细胞质内大部分的β-Catenin与细胞膜上Cadherin蛋白结合使之附着于细胞骨架蛋白肌动蛋白上，参与细胞的黏附作用。而少部分的β-Catenin被磷酸化后，与GSK3β等形成降解复合物，最终通过泛素化修饰而降解。Wnt信号的激活就是指分泌型的配体蛋白Wnt与膜表面受体蛋白FZD结合后，激活胞内蛋白DVL。DVL通过抑制GSK3β等蛋白形成的β-Catenin降解复合物的降解活性，稳定细胞质中游离状态的β-Catenin蛋白。胞浆中稳定积累的β-Catenin进入细胞核后结合LEF/TCF转录因子家族，启动下游靶基因（如c-myc、Cyclin D1等）的转录。可以把Wnt信号通路简单概括为：Wnt→FZD→DVL→β-Catenin降解复合体解散→β-Catenin入核→TCF/LEF→下游基因转录。它在细胞凋亡、增殖调控及肿瘤发生中有重要作用。Ad-MSCc-Exo处理通过减轻I/R和缺氧-复氧损伤(H/R)诱导Wnt/β-catenin信号的激活，从而抑制Wnt 3a、p-GSK-3β(Ser9)和β-catenin的表达。

➤ Wnt/PCP通路（Planar cell polarity pathway），通过小G蛋白激活JNK（c-Jun N-terminal kinase）来调控细胞骨架重排；

➤ Wnt/Ca2+通路，通过释放胞内Ca2+来影响细胞粘连和相关基因表达。

一般提到Wnt信号通路主要指的是由β-Catenin介导的经典Wnt信号通路。

低氧处理亲本MSC，会使其产生的外泌体内miR-22含量显著上升，进而提高抑制凋亡的能力——miR-22通过靶向甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)来抑制细胞凋亡。同样，通过MSC-Exos转导miR-21可通过提供抗细胞凋亡效应来增强心脏保护作用。miR-21参与多种细胞内信号转导通路，调节巨噬细胞中的凋亡蛋白，如PDC4、TLR4、NF-κB，以及PTEN/AKT/Bcl-2通路。低氧MSC-Exos通过上调靶细胞miR-24，抑制Bcl-2样蛋白-11(BIM)翻译(属于B细胞淋巴瘤-2[Bcl-2]凋亡调节蛋白家族的成员)抑制急性心肌梗死后心肌细胞的凋亡。也有研究发现低氧诱导的MSC-Exos通过miR-125B介导预防心肌梗死细胞凋亡、促进心脏修复的作用。

亲本MSCs基因表达的诱导改变会影响MSC-Exos的抗凋亡特性。GATA结合蛋白-4(GATA-4)过表达导致生长因子释放增加和血管生成；它还可以调节BMSC miR-15家族成员的表达，提高它们在缺血环境中的存活率。MSCs过表达GATA-4衍生的外泌体(MSCGATA-4-Exos)表达抗凋亡的miRNAs，减少缺陷心肌凋亡并保护线粒体膜电位。此外，MSCGATA-4-Exos处理的心肌细胞高表达miR-19a和miR-451，其中miR-19a通过靶向转录因子Sox-6，下调PTEN和BIM的表达，导致AKT和ERK信号通路激活，同时抑制JNK/caspase-3的激活。MSCGATA-4-Exos的心脏保护作用部分是通过miR-221介导的，它抑制了p53的凋亡调节因子(PUMA)，PUMA是Bcl-2蛋白家族中促凋亡的成员。

【总结】MSC-Exos中具有减少凋亡作用的分子“货物”有：miR-19a, 21, 22, 24, 125b-5p, 144, 221, 451, 486-5p。

由此在心肌细胞中的下游通路主要涉及：PTEN/PI3K/AKT/Bcl-2，经典Wnt通路；ERK通路；下调BIM、c-JNK、caspase-3。

三、MSC-Exos与心肌的炎症反应

急性心肌梗死后慢性、过度的促炎反应导致了不良的左心室重构（adverse left ventricular remodelling），该过程包括蛋白酶激活，细胞因子表达，心室的扩张，以及心脏成纤维细胞激活引起的过度纤维化。这一过程与恶化的临床结果密切相关，因此使针对心肌梗死后炎症的治疗成为限制心肌梗死范围的重要策略。MSC-Exos具有强大的免疫抑制抗炎作用，对心脏组织再生有重要意义。先前的研究表明，从促炎性免疫反应到耐受性免疫反应的转变可能有助于改善局部环境，促进增生修复。

MSC-Exos通过抑制大鼠心脏梗死区的免疫细胞浸润增殖来抑制急性心肌梗死期间的炎症反应：

①MSC-Exos处理后，心肌组织炎症浸润减少，特别是CD3+T细胞。

②MSC-Exos与外周血单个核细胞(PBMC)相互作用的体外研究也显示出类似的结果，因为共培养可增加CD3+T细胞的凋亡，同时减少了B细胞的增殖、分化以及在CpG刺激下产生IgM、IgG和IgA；周围培养上清液中免疫抑制因子IL-10的浓度也显著升高。

③MSC-Exos在体外以类似的方式抑制T细胞的分化、激活和增殖。

④MSC-Exos也参与调控（改善）心肌组织的纤维化。

其机制可能涉及：

①MSC-Exos表达程序性死亡配体1(PD-L1)、半乳糖凝集素-1和膜结合型转化生长因子-β，它们都是诱导免疫耐受所必需的分子。

②免疫调节性的miR-29和miR-24在MSC-Exos和MSCs中都高度表达，miR-29通过抑制众多胶原基因与减少纤维化有关，miR-24则被证实通过与一种名为几丁质酶-3样蛋白-1(CHI3L-1)的潜在的炎症和组织重塑调节剂相互作用来抑制主动脉血管炎症。

③MSC-Exos介导的miR-181a通过c-Fos蛋白相互作用抑制炎症反应，c-Fos蛋白是促进树突状细胞相关免疫功能的关键免疫激活剂。

④一个促炎的环境可影响MSC-Exos的合成，诱导它们通过miR-34a-5p、miR-21和miR-146a-5p的显著上调来促进M2巨噬细胞极化。MSC-Exos递送的miR-182通过TLR4/NF-κB/PI3K/AKT通路的相互作用来减轻心肌I/R损伤，进而调节巨噬细胞的极化。在体外和体内，MSC-Exos治疗促使促炎的M1巨噬细胞向抗炎的M2巨噬细胞的转变，进而促进了急性炎症到纤维化的转变。同时，M2巨噬细胞是抗炎IL-10的有效来源，IL-10对心脏纤维化有保护作用。尽管M2巨噬细胞的功能似乎相互矛盾，但一些报告显示，MSC-Exos改善了心肌梗死后的纤维化，可能与MSC-Exos中的miR-22和miR-133有关。

M2巨噬细胞的功能是将促炎症级联转化为减少的炎性级联，同时增强随后的修复活动。①M2巨噬细胞分泌TGF-β1诱导成纤维细胞转化成肌成纤维细胞，进而更有效地产生基质成分。②巨噬细胞通过趋化因子信号将这些细胞招募到损伤部位，由此产生的基质成分和胶原沉积稳定和交联，形成瘢痕组织；③M2巨噬细胞产生精氨酸酶进一步促进纤维化的形成（精氨酸酶激活谷氨酸和脯氨酸，这两种物质都是胶原合成所必需的）。

【总结】MSC-Exos中具有调节免疫作用的分子“货物”有：PD-L1，TGF-β，miR-21, 22, 24, 29, 34a-5p, 133, 146a-5p, 181a, 182。

四、外泌体研究的现状与未来

1.外泌体的研究之所以重要：

①受双层膜保护，稳定而高效。

②可操作性更强。

③安全，无致瘤性。

2.外泌体的应用所受到的阻碍：

①分离方法复杂且效率低（基于微流控技术的设备的出现可能有助于解决这些问题）。

②其中不仅含有保护因子，而且还运输有害成分。

③静脉注射后大部分聚积在肝、脾、胃肠道和肺中，只有少量的留在心脏内，且内皮细胞和成纤维细胞比心肌细胞更活跃地内吞外泌体。

3.外泌体研究的未来重点

（1）外泌体载药。

自然产生的外泌体中包含的保护物质将非常有限，但可以人为操纵外泌体内保护物质的浓度。有两种方法可以将货物装载到胞外体中：细胞内装载和细胞外装载。前者是由预处理或过度表达诱导的，导致亲本细胞向外泌体中装载更多的保护性物质；后者则是将保护性物质通过电转染、试剂转染、超声、皂苷、挤压和冻融等干预措施直接加载到外泌体中。目前装载的主要是蛋白质和miRNAs，对DNA、lncRNA、CircRNA的研究很少。

（2）心脏靶向治疗。

在临床前研究中，外泌体可通过静脉注射、冠状动脉内注射或心肌内注射给药。静脉注射后直接对心肌细胞发挥生物学作用的外泌体数量很少；肝脾等处积聚的高浓度外泌体则可能产生不利影响。冠状动脉内注射或心肌内注射操作复杂、需导管室、创伤较大，推广受限。

目前主要是通过“配体-受体”模型来实现心肌靶向。特定配体的基因被插入到外泌体表面发现的一种标记蛋白的基因中。这种融合蛋白一旦在亲本细胞中表达，就可以定位在外泌体膜上，融合蛋白将作为配体，特异性识别靶器官上的受体。广泛使用的外泌体蛋白标记物包括乳黏附素、溶酶体相关膜蛋白-2b(LAMP-2b)和PDGF受体。

此外，将氧化铁纳米颗粒等磁性物质与治疗药物一起装载到外泌体，是实现靶向治疗目标的另一种有希望的策略。

（3）改善获取外泌体的来源。

目前研究常用的外泌体来源，如CDC、CPC、内皮细胞、心肌细胞、心包液、ESCs和心外膜干细胞，获取的量都不大。

a.优化分离方法。

b.最近考虑的潜在的更“robust”的来源：iPSCs；血浆提取；永生化细胞，例如慢病毒介导的myc转染而永生的BMSC（单纯BMSC在体外经过几轮增殖后衰老）。

c.合成“人工囊泡”或聚合体。聚合体由两亲性线性嵌段共聚物(或微臂聚合物)制备，方法有：溶剂交换法（因其简便性、重复性和对囊泡大小的控制而被广泛使用）、膜复水化、电形成和复乳化法。

（4）现实世界研究。

当缺血性心脏病与其他疾病(如糖尿病或高脂血症)合并时，心脏微环境会发生变化，细胞对干预措施的反应也会不同。因此，在出现其他疾病的并发症时，外泌体是否仍有保护作用尚不清楚，且干预策略也可能要进一步优化。这可能是大多数研究都未能将临床前实验中的积极结果转化为临床实践的原因之一。

在1型和2型糖尿病模型中，预处理和后处理未能缩小缺血再灌注所致的心肌梗死范围，主要是由于再灌注损伤挽救激酶(Risk)相关蛋白PI3K/Akt、ERK、p70S6K和GSK-3β的激活受损所致。在这类人群中，外泌体和其他药物一样，可能无法显示出理想的治疗效果；然而，Risk途径中所需的蛋白质等也可以被装载到外泌体中，并转移到心肌细胞。在这种情况下，外泌体有潜在的靶向修复这些受损机制、使心脏保护信号激活的效果。这一思路也可以进一步推广到其他疾病中。