水刊，铜死亡相关lncRNA特征可预测膀胱癌的预后

2023-08-15 17:38 作者:275276 0人读过 | 我要投稿

结果

该研究的流程图如图所示，共有 394 名 BLCA 患者从 TCGA-BLCA 队列中入组，其临床特征详细概述于表格1。

数据收集和分析的流程图。缩写：BLCA：膀胱尿路上皮癌；TCGA：癌症基因组图谱；KEGG：京都基因和基因组百科全书；GO：基因本体论；lncRNA：长非编码RNA；LASSO：最小绝对收缩和选择算子；ROC：接收器工作特性；GSEA：基因富集分析；ssGSEA：单样本基因集富集分析。

铜凋亡相关lncRNA预测特征的构建

总共鉴定了 548 个与铜凋亡相关的 lncRNA（补充表 1）。单变量 Cox 回归分析显示，135 个 lncRNA 与 BLCA 患者的预后相关。LASSO Cox回归模型筛选了20个lncRNA。对 20 个 lncRNA 进行多变量 Cox 回归分析以创建预测特征，最终确定了一组 8 个 lncRNA（AC005261.1、AC008074.2、AC021321.1、AL024508.2、AL354919.2、ARHGAP5-AS1、LINC01106、 LINC02446）。BLCA患者中8个铜凋亡相关lncRNA的表达热图显示在图2C。我们使用 Cytoscape 软件和 R 包“ggalluvial”进一步可视化 lncRNA。共表达网络包含 9 对 lncRNA-mRNA。AC005261.1与DLAT有共表达关系；AC008074.2与LIPT1有共表达关系；AC021321.1与DBT有共表达关系；AL024508.2与LIAS和LIPT1有共表达关系；AL354919.2与SLC31A1有共表达关系；ARHGAP5-AS1与FDX1有共表达关系；LINC01106与LIPT1有共表达关系；LINC02446 与 NLRP3 具有共表达关系。AC005261.1、AC008074.2、AC021321.1、AL024508.2、AL354919.2、LINC01106和LINC02446是保护因素，而ARHGAP5-AS是危险因素。风险评分计算如下：风险评分 = 0.372 × ARHGAP5-AS1 表达水平 − 0.500 × AC005261.1 表达水平 − 0.620 × AC008074.2表达水平 − 1.204 × AC021321.1表达水平− 0.415 × 表达水平AL024508.2 的水平 - 0.592 × AL354919.2 的表达水平 - 0.613 × LINC01106 的表达水平 - 0.738 × LINC02446 的表达水平。使用上述公式评估每位BLCA患者的风险评分后，根据风险评分的中位数将患者分为高风险组和低风险组。与低风险组相比，高风险组的 OS 时间显着缩短 ( p < 0.001)。高风险组和低风险组的风险评分如下。随着风险评分的增加，对可用变量进行了单变量和多变量 Cox 回归分析，以确定它们与较高的患者死亡人数之间的关系。单变量 Cox 回归分析表明年龄、分期、T 分期、N分期和风险评分与 OS 显着相关。此外，多元 Cox 回归分析表明，风险评分是 OS 的独立预测因子。风险评分的 AUC 为 0.782，这是预测 BLCA 患者预后的可用变量中最好的。根据时间ROC分析，预测特征具有良好的预测性能，1年、3年和5年的AUC分别为0.757、0.775和0.777。此外，在分析高危组和低危组之间临床病理变量的差异后，我们发现分期（p <0.001）、T分期（p <0.05）、N分期（p <0.05）、高风险组和低风险组之间的等级（P <0.01）和fustat（p <0.001）

铜凋亡相关 lncRNA 预测特征的构建。( A ) 135 个 lncRNA 表达的 LASSO 系数曲线。( B ) 通过 20 倍交叉验证选择 LASSO 模型中的惩罚参数 (λ)。( C )八种铜凋亡相关lncRNA在肿瘤和正常组织中的表达水平。( D ) 预后铜凋亡相关 lncRNA 的共表达网络。( E ) 基于预后铜凋亡的 lncRNA 的 Sankey 图。缩写：lncRNA：长非编码 RNA；N：正常；T：肿瘤。

BLCA 患者的预测特征与预后之间的相关性。( A )高危组和低危组BLCA患者OS率的Kaplan-Meier分析。( B ) BLCA 患者风险评分的分布。( C ) 具有不同风险评分的死亡和存活患者的数量。蓝色代表幸存者人数，黄色代表死亡人数。( D ) 单变量 Cox 回归分析的森林图。( E ) 多元 Cox 回归分析的森林图。( F ) 风险评分和临床病理变量的 ROC 曲线。( G) 预测特征的 1 年、3 年和 5 年生存率的 ROC 曲线和 AUC。缩写：BLCA：膀胱尿路上皮癌；OS：总生存期；ROC：接收器工作特性；AUC：曲线下面积；T：肿瘤；N：淋巴结；M：转移。

高危组和低危组中五种预后铜凋亡相关lncRNA和临床病理变量的分布热图。缩写：lncRNA：长非编码 RNA；T：肿瘤；N：淋巴结；M：转移。

列线图的设计

我们创建了包含临床病理因素和风险评分的列线图，以简化预测特征的临床使用。列线图显示它可以帮助我们预测 BLCA 的 1 年、3 年和 5 年生存率。校准曲线显示预测和实际 1 年、3 年和 5 年总体生存率之间存在很强的相关性

列线图创建和验证。( A ) 结合临床病理变量和风险评分的列线图可预测 BLCA 患者的 1 年、3 年和 5 年 OS 率。( B – D ) BLCA 中 1 年、3 年和 5 年 OS 列线图模型的校准曲线。缩写： OS：总生存期；BLCA：膀胱尿路上皮癌；N：淋巴结；M：转移。

BLCA 患者临床病理变量的预测特征与预后之间的关系

我们对不同年龄、性别、分级、分期和肿瘤淋巴结转移（TNM）分期进行亚组分析，以研究 BLCA 患者的预测特征与预后之间的关系。我们发现，从年龄、性别、高级别、III-IV期、T3-4分期、N分期和M0分期来看，高危组BLCA患者的OS较低危组短

根据不同临床病理变量分类的患者高风险组和低风险组的 Kaplan-Meier 生存曲线。( A , B ) 年龄；( C、D ) 性别；( E ) 高级；( F ) III-IV 阶段；（G）T3-4阶段；( H , I ) N级；( J )M0阶段。缩写：T：肿瘤；N：淋巴结；M：转移。

铜凋亡相关 lncRNA 预测特征的内部验证

为了验证基于整个 TCGA 队列的 OS 预测特征的准确性，我们将 394 名 BLCA 患者随机分为两个队列：训练队列和测试队列（表格1）。在训练队列中，高危组患者的 OS 率低于低危组

基于整个 TCGA 数据集验证操作系统的预测签名。( A ) 训练队列中的 Kaplan-Meier 生存曲线。( B ) 测试队列中的 Kaplan-Meier 生存曲线。( C ) 训练队列中 1 年、3 年和 5 年生存率的 ROC 曲线和 AUC。( D ) 测试队列中 1 年、3 年和 5 年生存率的 ROC 曲线和 AUC。缩写： OS：总生存期；TCGA：癌症基因组图谱。ROC：接收器工作特性；AUC：曲线下面积。

1年生存率的AUC为0.775，3年生存率为0.842，5年生存率为0.885。测试队列中高风险组患者的预后也比低风险组差，1 年生存的 AUC 为 0.735，3 年生存的 AUC 为 0.71，5 年生存的 AUC 为 0.688。这些结果与整个 TCGA 队列的结果一致，证明预测特征可以作为 BLCA 患者预后的可靠预测因子。

不同风险患者之间的功能富集分析

为了证明不同风险水平患者的生物学功能和与风险评分相关的通路，我们进行了功能富集分析。通过对高风险组和低风险组进行 GSEA，我们能够发现它们之间可能存在的差异。正如预期的那样，我们观察到与低风险组相比，高风险组的免疫相关生物过程和肿瘤相关信号通路显着丰富。这些通路包括细胞周期、ECM受体相互作用、紧密连接、WNT信号通路、MAPK信号通路、P53信号通路、TGF-β信号通路、细胞间连接、细胞对铜离子的反应、免疫记忆过程、T细胞受体复合物、细胞对缺氧反应的调节等

高风险组和低风险组之间预测特征的 KEGG 和 GO 富集分析。( A )KEGG富集分析；( B )GO富集分析。缩写：KEGG：京都基因和基因组百科全书；GO：基因本体论。

免疫浸润水平分析

为了分析免疫浸润水平，我们利用主成分分析 (PCA) ，使我们能够根据患者的全基因组、铜凋亡相关基因集、铜凋亡相关 lncRNA 和预测特征来可视化患者的分布。结果表明预测特征对患者来说是最好的。此外，为了研究风险评分与免疫细胞和通路之间的关联，我们计算了关于不同免疫细胞亚群及其相关通路的 ssGSEA 富集得分。分析证实了两个风险组之间未成熟树突状细胞（iDC）、巨噬细胞、肥大细胞、2型辅助性T细胞（Th2）、调节性T细胞（Tregs）、趋化因子受体（CCR）和副炎症的差异。鉴于检查点免疫疗法的重要性，进一步观察到两个风险组之间存在差异。与低风险组相比，高风险组的PD−L1表达要高得多。结果表明，抗 PD-1/L1 免疫疗法可能对高危个体有效。除了免疫治疗之外，我们还分析了常见药物对 BLCA 疗效的影响。结果显示，高危组中顺铂、多西他赛、伊马替尼、拉帕替尼、紫杉醇、小白菊内酯、帕唑帕尼和毒胡萝卜素的 IC50 值较低，但高危组中甲氨蝶呤、MK.2206、MS.275、PD.0332991、替西罗莫司、长春瑞滨和伏立诺他的 IC50 值较高，有助于研究高风险和低风险类别 BLCA 患者的专门治疗方案。

高风险和低风险评分的患者具有不同的免疫状态。PCA图显示基于（A）全基因组的患者分布；( B ) 铜凋亡相关基因组；( C )铜凋亡相关lncRNA；( D ) 预测签名。ssGSEA 评分结果免疫细胞评分 ( E ) 和免疫功能评分 ( F）箱线图中高风险组和低风险组之间的关系。缩写：PCA：主成分分析；lncRNA：长非编码RNA；ssGSEA：单样本基因集富集分析。aDC：激活的树突状细胞；iDC：未成熟的树突状细胞；NK：自然杀手；pDC：浆细胞样树突状细胞；Tfh：T 卵泡辅助器；Th1：T辅助1型；Th2：T辅助2型；TIL：肿瘤浸润淋巴细胞；Treg：调节性T细胞；APC：抗原呈递细胞；CCR：趋化因子受体；HLA：人类白细胞抗原；MHC：主要组织相容性复合体；IFN：干扰素。

高危组和低危组治疗药物敏感性比较。( A )高风险组和低风险组中PD-L1的表达。( B ) 顺铂在高危和低危人群中的IC50。( C )多西紫杉醇在高风险组和低风险组中的IC50。( D )伊马替尼在高风险组和低风险组中的IC50。( E )拉帕替尼在高风险组和低风险组中的IC50。( F ) 紫杉醇在高危和低危人群中的IC50。( G ) 小白菊内酯在高危和低危人群中的IC50。( H ) 帕唑帕尼在高危和低危人群中的 IC50。(一)毒胡萝卜素在高、低危人群中的IC50。( J) 甲氨蝶呤在高危和低危人群中的IC50。( K ) MK.2206 在高风险组和低风险组中的 IC50。( L ) MS.275 在高风险组和低风险组中的 IC50。( M ) PD.0332991 在高风险组和低风险组中的 IC50。( N )替西罗莫司在高危和低危人群中的IC50。( O )长春瑞滨在高危和低危人群中的IC50。( P ) 伏立诺他在高危和低危人群中的IC50。缩写：IC50：半数最大抑制浓度。

风险评分/8个铜凋亡相关lncRNA与临床病理变量之间的相关性

我们使用基因表达和 TCGA 数据库中的相应临床数据分析了临床病理变量和风险评分/8 个铜凋亡相关 lncRNA 之间的相关性。结果显示AC005261.1与年级相关；AC008074.2与 fustat 相关；AC021321.1与 fustat、级别、分期、T 分期和N分期相关；AL024508.2 与 fustat、级别、分期、T 分期和N分期相关；AL354919.2 与年龄、fustat、分级、分期和 TNM 分期相关；LINC02446 与年级和 M 期相关；风险评分与fustat、等级、分期、T分期和N分期相关。

验证指定细胞系中铜凋亡相关 lncRNA 的表达

我们选择了三种 BLCA 细胞系来检查其 mRNA 表达水平，以进一步评估铜凋亡相关 lncRNA 的表达。对照组为正常膀胱细胞系SV-HUC1。LncRNA AC005261.1、AC021321.1、AL024508.2、LINC02446和LINC01106在肿瘤细胞中低表达，而ARHGAP5-AS1表现出相反的趋势。

通过定量 PCR 验证结果。四种细胞系（SV-HUC-1、5637、BIU-87 和 T24）中铜凋亡相关 lncRNA 的相对 mRNA 表达。

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