谁也不想 WB 总出错！打败玄学，配图详解 WB 翻车的9个致命伤！
western blot做太多的同学，通常会有一种错觉，这不是在做科研，这是在跟玄学做斗争！
条带失踪、背景漆黑杂带丛生真是家常便饭了，另外还得到了一个冷知识，这世界上最恐怖的笑，莫过于WB冲你邪魅一笑！
针对高频WB异常结果，配图详解 12 个WB翻车结果及7个灵魂提问解答，还有电泳和转印环节、跑胶经验吐血汇总！这些内容没有个十年脑溢血根本总结不出来！
这里也为大家准备了免疫实验技术手册，包括免疫三剑客WB / IHC / ELISA，还有FC / IP / IF / FC / ChIP，有需要可以自行下载！
12个高频异常结果
#1 无背景无条带
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上图展示一点信号都没有，大部分情况是因为抗体加错了。如果中间出现细微的条带，可能是蛋白上样量太少，一抗浓度过低，ECL 发光液失效。
#2 高背景
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高背景是 WB 实验中最常见的问题，目的条带单一清晰，但其他地方又弥漫性较均一的背景（比较连续的）。杂带多大概率是抗体特异性不好，也有可能抗体浓度太高，可尝试降低一抗浓度进行实验。
#3 非特异性条带
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此种情况绝大多数是因为一抗不好，你无法判断哪一条是目的条带。如果实在没有更好的抗体，建议采用阴性对照和阳性对照来确定上述哪个条带是目的条带。当然也有一种很小几率的可能是一抗浓度太高引起的非特异性结合。
#4 条带中出现边缘规则的白圈
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我们常常将电转液倒入一个盘子里，倒入的液体不宜太多或太少，建议高度与放上第一层滤纸齐平，然后往滤纸上浇点转膜液，往胶上面浇点电转液，用两只手的拇指和食指轻轻夹住 NC 膜的两侧中间，使膜成 U 型，然后将 U 型底部接触胶的中间，慢慢往两边放下膜，这样一般气泡很少。然后上层滤纸同样用 U 型的放置方法，用玻璃棒稍微贴实下，最后盖上海绵。
#5 出现黑点和黑斑
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牛奶溶解后，最好静止一下，然后轻轻吸取上层牛奶进行封闭，封闭结束后一定要洗 3 遍之后再加一抗。
#6 条带拖尾
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这种情况一般出现在大分子量抗体实验中，是因为一抗浓度太高，作用时间太长引起的。另外洗一抗和洗二抗千万不要偷工减漏，建议 5min*5 次，不要担心洗这么多次把抗体和蛋白洗掉了，真正的抗原抗体相结合通过这种方式是洗不掉的。
#7 出现非均一性背景
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封闭时洗一抗洗二抗，以及发光时都应时刻注意切记蛋白面风干，一旦风干很可能会导致这个结果。
#8 某个条带变形
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很多实验室中使用的不是最新设备，比如配胶用的海绵垫，如果用了很多年，会从下面往上面漏小气泡，当气泡足够小并且胶快凝固的时候，走到中间的小气泡就停留在胶内，并会影响到后面的跑胶。另外配胶用的水，SDS，Tris 缓冲液要注意不要有杂质。
#9 条带不均一
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出现哑铃最大的可能是胶没有配好，胶凝固后不均一。如果你拔完梳子后出现上图中下面部分的情况，多半会出现哑铃状。另外还有一种可能是样品中含有太多杂质，没有离心下来，然后杂质沉积在孔的中间，蛋白自然被推挤到两边。
#10 最边缘条带弯曲
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一般我们使用的是 10 孔的胶，如果你上样刚好 10 个孔，那么最两头的两个孔肯定会歪曲。另外上样最好在胶的中间，这样电场均一。
#11 条带笑脸，marker正常
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准备样本主要确认上样缓冲液是否为近期配置，并且要妥善保存，否则就会浪费珍贵的实验样本。一般电泳过程中恒压电泳，浓缩胶 80V，分离胶 120V，整个过程差不多需 2 个小时左右。
#12 曝光结果条带扭曲
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对于大分子量的抗体，跑胶前可以先把样本煮一下，然后稍微离心一下，同样也可以改善这种情况。
7个灵魂提问
#1 为啥条带形状不好看？
可能的原因有：
a.胶凝的不均匀或聚合不好，建议灌胶前将溶液充分混匀
b.某些样品盐浓度较高，建议除盐或将样品盐浓度调成一致
c.缓冲液陈旧，成分改变,可以重配
d.凝胶下面有气泡,电泳前要先将气泡赶走
e.电泳时温度过高，可以降低电流或电压
f.样品中含有不溶性颗粒，建议样品充分搅拌混匀
#2 蛋白条带位置（大小）不对咋整？
可能的原因有：
a.胶浓度不对，不同浓度的胶跑出的蛋白条带的位置可能有所偏差，可以调整浓度
b.抗体孵育不充分,建议增加抗体浓度，延长孵育时间
c.酶失活，建议直接将酶和底物进行混合，如果不显色则说明酶失活了。选择在有效期内、有活性的酶联物
d.目的蛋白存在翻译后修饰或剪切体，建议查询相关文献确定
e.标本中不含靶蛋白或靶蛋白含量太低，建议设置阳性对照比对结果，增加标本上样量
#3 暗背景上白色带是咋回事？
可能的原因有：
a.抗体与封闭试剂反应，建议使用前过滤封闭试剂
b.HRP含量过高，建议降低酶联二抗的浓度
c.HRP偶联二抗中有聚集体，建议过滤二抗试剂，去除聚集体
d.抗体分布不均匀，建议孵育抗体时使用摇床
#4 细胞提取液中没有检测到目的蛋白？
可能的原因有：
a.细胞中不表达这种蛋白质，换一种细胞；
b.抗体不能识别目标蛋白，多看看说明，是否有问题；
c.可能是没有保持低温操作，样品保存不当，样品放置时间过长；
d.细胞中的蛋白质被酶降解掉了，可加入蛋白酶抑制剂，抑制蛋白酶活性。
#5 目的带很弱，如何加强？
a.可以加大抗原上样量，这是最主要的；
b..也可以将一抗稀释比例降低；
c.还可以延长曝光时间。
#6 我做的蛋白质分子量很小(10KD)，怎么做WB?
a.可选择孔径0.22um的PVDF膜或者NC膜，转膜时间缩短，另外可采用Tricine-SDS-PAGE体系；
b.也可以选择PSQ 膜，同时缩短转移时间。也可以将两张膜叠在一起，再转移。其他按步骤即可。
#7 有很多杂带咋回事？
可能的原因有：
a.目的蛋白有多个修饰位点，本身可以呈现多条带，建议查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小
b.样本处理过程中目的蛋白发生降解,建议加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作
c.杂蛋白多，建议处理目的蛋白
d.抗体特异性不强，建议使用特异性强的抗体
e.抗体孵育时间过久，建议减少抗体孵育时间
f.二抗与抗原有交叉反应，建议选择合适的封闭物
g.二聚体或多聚体存在，建议增加蛋白质变性过程及强度
h.底物显色与曝光时间过长，建议缩短显色及曝光的时间
电泳和转印环节的 11 条 Tips
Tip 1：洗净上样孔
在加样之前，用移液枪吹洗每个上样孔，洗净残留在上样孔中的丙烯酰胺残渣，从而避免畸形条带的出现。
Tip 2：凝胶过热是大忌
如果凝胶在电泳过程中温度过高，则条带可能会出现「微笑」形状，即条带两侧向上弯曲的现象。切记要正确使用缓冲液，并控制好电泳功率，避免凝胶过热的出现。
Tip 3：确保样品缓冲液离子强度正确
样品中的盐离子强度过高（或过低），都会导致条带出现偏斜或扭曲。如果样品提取过程中用到高盐溶液，就有可能要在上样前进行稀释或脱盐处理。
Tip 4：不要过载上样
加大上样量有利于检测稀有目标蛋白。但过大的上样量会导致电泳过程中出现垂直条纹。如果必须大量上样时（> 30 ug 总蛋白），可将电泳电压降低 25％，有助于减少条纹。
Tip 5：转印三明治要去除气泡
均匀的蛋白质转印需要三明治的各组件之间完全接触，尤其是凝胶和膜完全接触。没有去除的气泡会导致膜上出现空白点，直接影响实验结果！建议使用凝胶滚轮将这些气泡通通赶走！（提示：梯度凝胶最好上下滚动，而不是左右滚动。左右滚动会导致梯度凝胶翘曲和起皱。）
Tip 6：转印前的预平衡
湿转和传统半干转时，将凝胶电泳缓冲液替换为转印缓冲液可获得更好的转印效果。电泳缓冲液的带入会增加电导率，从而导致转印过程中产生过多的热量。可在水中短暂冲洗凝胶，然后在转印缓冲液中平衡凝胶 15 分钟，平衡膜 5 分钟。请注意，对于某些快速转印系统，不建议使用凝胶预平衡，请遵循制造商的操作指南。
Tip 7：NC 膜转印时避免使用 SDS
转印缓冲液中的 SDS 会降低蛋白质与硝酸纤维素膜的结合效率，所以在使用 NC 膜时要避免缓冲液体系内有 SDS。转印前用水冲洗凝胶，以便减少 SDS 带入转印体系。
Tip 8：PVDF 膜可使用 SDS
SDS 可以促进蛋白质从凝胶中洗脱，如果某些蛋白质难以从凝胶中洗脱，则可以将 SDS 添加到转印缓冲液中，前提是必须使用 PVDF 膜。
Tip 9：避免膜变干
在转印之前和之后均需保证膜的湿润，从转印三明治中取出后，转印热量会使膜容易变干燥。应迅速将膜浸入预先准备好的缓冲液中，以免膜干燥。（尤其是在使用 PVDF 膜时要格外注意，因为 PVDF 膜是疏水的更容易变干）。如果干了，可将硝酸纤维素膜重新在缓冲液中浸湿，而 PVDF 膜则需要在醇中重新活化。
Tip 10：半干转印功率及时间设置
使用高电场转印可获得更高的转印效率，但是一定要注意系统的散热能力，避免凝胶过热。转印期间，「三明治」温度升高会导致电阻变化，进而引发转印效率不均一，缓冲液失去缓冲能力，甚至凝胶融化。半干转印在电流下降接近为零时，延长转印时间不会增加转印效果。
Tip 11：使用两张膜判断蛋白是否会转穿
薄胶或低浓度胶转印过程中蛋白容易转穿，特别是针对小分子量蛋白。可以转印时叠放两张转印膜，然后对第二张膜进行总蛋白染色（丽春红或 Stain-Free 免染）的方法来判断是否已经转穿。
提高跑胶质量的7条Tips
Tip 1：蛋白分子量偏高或偏低
可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应，比如说 100KD 的蛋白你用 12% 的胶跑，或者说 20KD 的蛋白你用 8% 的胶跑。
Tip2：蛋白质降解
蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带，然后出现一些其他带，最主要的特点是所有的条带比正常的都低，并且条带模糊不清晰。
Tip3：所有条带连成一片无间隔
最可能是上样量过多，其次是样品弥散（比如电泳长时间停止样品弥散）。
Tip4：溴酚蓝拖尾
样品溶解不好或上样前未变性完全。
Tip5：纵向的纹理
上样样品中存在不溶性颗粒。
Tip5：溴酚蓝很粗
浓缩胶浓缩效果不好，可能是浓缩胶太短或者配错。
Tip7：在分离胶中跑不动
Tris-Cl pH 值不对，或者忘记加 SDS。
