不想盲目蹭热点，已成熟的方向如何继续进行生信挖掘？免疫微环境+单细胞数据挖掘+机器
小云一直致力于给粉丝大大们收集、分享各种生信分析的热点方向和新思路，比如，铁死亡、铜死亡、失巢凋亡的纯生信数据挖掘等。这对于要做基础研究的临床医生来讲，可谓最具有性价比的入手方式。
然而，科研是要讲连贯性和延伸性的，特别是近年来竞争越来越大的国科金申报，更加注重研究基础，讲求积累和衔接。所以小云推荐，可以追热点，但是不要一直换热点，尤其不要盲目换热点去蹭，打一枪换一个地方，很难有积累。
每个研究方向除了刚开始提出时的极端红利期外，总是会逐渐走向稳定阶段的，这是客观规律。那么，对于那些已经相对成熟，且前期我们已经投入了不少资源的方向，如何继续跟踪深挖、持续积累、开拓创新了？
小云的绝招是，研究方法和关注角度的拓展及更新。通过“嫁接”和“移植”，老树可以开新花，拓展关注的视角，以新的角度解释成熟的内容，并且也同时提高了问题的深度，对于国科金申报可谓是事半功倍。（如果没有分析思路或者文献复现有困难，可以找小云，超多创新性高的分析思路和分析服务供你选择！）
怎么才能做到研究方法和关注角度的拓展及更新？免疫微环境+单细胞数据挖掘+机器学习是近年来的常见分析热点。如下图可示，“自噬”方向已经过了快速增长期，22年发文数甚至有点小降。那小云就以“自噬”为例，选择了一篇文献，来分享一下如何依赖新的分析方法，实现自噬在肿瘤里的复现。
l 题目：鉴定卵巢癌预后和免疫治疗反应预测的自噬相关基因
l 杂志：Biomolecules
l 影响因子：IF=6.0
l 发表时间：2023年2月
研究背景
卵巢癌（OC）是女性生殖系统恶性程度最高的肿瘤之一，预后较差。由于患者的个体特征，在患者中观察到对化疗和免疫疗法等治疗的不同反应，目前仍缺乏用于风险预测的预后标志物。自噬与包括 OC 在内的肿瘤的发生和发展密切相关，但是自噬相关基因是否可以作为 OC 患者的预后标志物仍有待研究。
数据来源
研究思路
从TCGA数据库下载374例OC患者的基因转录组数据。通过单样本基因集富集分析 (ssGSEA) 确定了自噬水平与 OC 患者预后之间的相关性。通过免疫组织化学 (IHC) 测定法检测不同临床标本中自噬标记物的表达。应用基因集富集分析（GSEA）、ESTIMATE和CIBERSORT分析探讨自噬与肿瘤免疫微环境（TME）的相关性。对 OC 患者的单细胞 RNA 测序数据分析，比较高、低自噬水平的肿瘤细胞间相互作用模式。利用机器学习、Cox 回归和 LASSO-Cox 分析用于筛选自噬关键基因，并对这些基因构建预后模型。
主要结果
1. 自噬水平与 OC 患者的预后显著相关
作者根据基因表达谱矩阵对 OC 患者进行自我聚类，发现可将患者分为自噬水平显着不同的两个簇，而细胞凋亡、坏死性凋亡和铁死亡三种类型的 PCD 中没有观察到这样的结果（图 1A）。Kaplan-Meier 生存分析发现自噬水平较高的患者预后较差（p = 0.0079，图 1 B)。与自噬水平低的患者相比，自噬水平高的患者发生淋巴转移的比例更高（图 1C）。进一步验证试验发现，与正常卵巢组织相比，OC组织中LC3B和Beclin1的表达水平升高，而p62的表达水平降低（图1 D）。LC3B 和 Beclin1 的表达水平在顺铂耐药的 OC 组织中高于顺铂敏感的 OC 组织，并且 p62 的表达水平被逆转（图 1 E ）。综上所述，这些结果表明自噬水平与 OC 患者的预后显着负相关。（ps：热图和火山图也可以用小云新开发的零代码生信分析小工具实现，云生信分析工具平台包含超多零代码分析和绘图小工具，上传数据一键出图，感兴趣的小伙伴欢迎来尝试哟，网址：http://www.biocloudservice.com/home.html）。
图1自噬水平与 OC 患者的预后显著相关
2. 自噬与 OC 中的免疫微环境显着相关
作者对自噬相关基因进行了GSEA分析，发现免疫相关信号在自噬高组中呈正向富集（图2A），免疫相关基因（CD28、CD4、CD274、CTLA4、TLR2、TLR4、TICAM2、LCP2、ITK、PTPRC、EGF、JAK1 和 mTOR）的表达水平在自噬高组中上调（图 2B）。其他免疫相关基因在高自噬亚组中也显着更高（图 2 C）。
图2 自噬与 OC 中的免疫微环境显着相关
ESTIMATE 分析表明，与自噬低组相比，自噬高亚组的免疫评分升高（p = 0.024，图 3A）。CIBERSORT 分析发现浸润性幼稚 B 细胞、CD4 记忆静息 T 细胞和 M2 巨噬细胞的水平在自噬高组中显着更高（图 3 B、C)。通过 IHC 检测发现在肿瘤中观察到更多CD163 信号（M2 巨噬细胞）（图 3 D）。这些数据表明自噬水平与 OC 免疫微环境之间存在相关性。
图3 自噬与 OC 中的免疫微环境显着相关
3. 巨噬细胞有助于 OC 的自噬相关免疫微环境
根据来自 scRNA-seq 的基因表达，为来自七个肿瘤组织的肿瘤细胞进行自噬评分。UMAP 图显示不同细胞簇的自噬分数存在差异（图 4 A、B），表明这些细胞处于不同的自噬水平。此外，通过配体-受体相互作用评估研究肿瘤细胞和巨噬细胞之间的相互作用。在高自噬肿瘤细胞和巨噬细胞之间观察到更多的配体-受体相互作用（图 4 C)。有两个巨噬细胞簇，根据基因表达鉴定为 M1 样和 M2 样（图 4D、E）。这些数据表明自噬可能通过促进巨噬细胞极化来影响 OC 的免疫微环境。
图4巨噬细胞有助于 OC 的自噬相关免疫微环境
4. 自噬相关基因集的获取及诊断模型构建
作者通过随机森林（RF）筛选出30个与自噬相关的hub基因，并对根据它们在自噬过程中的重要性进行排序（图 5A）。经过多变量 cox 比例风险回归分析，筛选出8个风险基因（ZFYVE1、AMBRA1、LAMP2、TRAF6、PDPK1、ATG2B、DAPK1 和 TP53INP2）（图5B)。Kaplan-Meier生存分析显示，高危组患者（TCGA）的总生存期（OS）明显短于低危组（p < 0.05）（图5C、D）。在两个 GEO 队列中验证了自噬相关特征的预后价值，获得结果一致（图 5E）。
图5 自噬相关基因集的获取及诊断模型构建
5. 自噬相关特征基因可用于预测 OC 的 ICIs 治疗效果
作者发现在IMvigor210队列中，抗PD-L1免疫疗法有反应的患者具有更高的自噬风险评分（图6A）。同时，抗PD-1治疗有部分反应(PR)的患者表现出比疾病进展(PD)患者更高的自噬风险评分（图6B）。这一发现表明，自噬风险评分较高的患者可能对抗PD-L1免疫疗法有更好的反应。
图6 自噬相关特征基因可用于预测 OC 的 ICIs 治疗效果
文章小结
这篇文章是将“自噬”这个较为成熟的点和“免疫微环境”这个新热点进行整合，再结合“单细胞测序”角度，将自噬再与巨噬细胞进行串联，最后结合使用随机森林等“机器学习”分析方法，来构建出基于“自噬”的肿瘤预后模型。特别适合于前期已有一些研究，后期计划进行新的探索。不论是项目开题（硕士、博士），还是国自然前期基础延伸，或者是功能基因的功能试验，都具有重要作用。
