去泛素化酶USP22调节人类癌细胞中的PD-L1降解
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今天推荐的是由山东大学生命科学学院在2020年7月14日发表于Cell Communication and Signaling（2020IF：5.712，JCRQ2）的一篇文章，通讯作者是Xiangguo Liu教授，研究表明去泛素化酶USP22调节人类癌细胞中的PD-L1降解。
研究背景
许多癌症通过过度表达PD-L1来逃避免疫监视。PD-L1与其受体PD-1相互作用，导致T细胞增殖和活化减少，随后由T淋巴细胞介导的癌细胞死亡。了解调节PD-L1的机制对于免疫检查点阻断疗法(ICBT)至关重要。
摘要部分
作者的数据显示USP22与PD-L1相互作用并促进其稳定性。USP22去泛素化PDL1并抑制其蛋白酶体降解。此外，USP22还与CSN5相互作用并通过去泛素化稳定CSN5。USP22或CSN5都可以促进PD-L1与另一个的相互作用。此外，USP22去除了CSN5和PD-L1的K6、K11、K27、K29、K33和K63连接的泛素链。另一方面，USP22敲低抑制了肿瘤发生并促进了T细胞的细胞毒性。作者还发现在人类非小细胞肺癌样本中，USP22表达与PD-L1表达呈正相关。
研究内容
1.USP22调节NSCLC细胞中的PD-L1蛋白水平
作者在BioGRID数据库中搜索了PD-L1的潜在相互作用因子。根据质谱数据，作者发现USP22是候选调节剂。为了证实USP22的特异性，作者敲低了H1792和H1299细胞中的USP4、USP7和USP22。结果表明，USP22的敲低而不是USP4或USP7的敲低降低了PD-L1蛋白水平。在7个NSCLC细胞系中筛选USP22和PD-L1蛋白表达后，作者发现PD-L1蛋白水平与USP22表达呈正相关。这些数据暗示USP22可能是PD-L1的有效调节器。为了验证作者的假设，作者在三种NSCLC细胞系中用不同的siRNA干扰了USP22表达。
USP22的敲低导致内源性和外源性PDL1蛋白水平的下调。在乳腺癌和结肠直肠癌细胞系中观察到类似的结果。一致地，USP22的异位表达提高了PD-L1蛋白水平。基于这些结果，作者认为USP22是PD-L1的调节器。USP22是SAGA转录共激活因子复合物的一个亚基，因此作者探究USP22是否在转录水平调节PD-L1。然而，PD-L1 mRNA不受USP22敲低的影响。因此，作者想知道USP22是否调节PD-L1蛋白降解。蛋白酶体抑制剂MG132挽救了USP22敲低诱导的PD-L1下调，表明USP22敲低诱导了PD-L1蛋白酶体降解。此外，作者使用放线菌酮(CHX)，一种蛋白质合成抑制剂，来探索USP22是否影响PD-L1稳定性。作者的数据显示USP22敲低降低了PD-L1的稳定性，而USP22过表达延长了PD-L1蛋白半衰期。
研究结论：USP22参与了人癌细胞中PD-L1的蛋白酶体降解。
2.USP22与PD-L1直接相互作用
已经证明USP22可以调节PD-L1蛋白水平，作者探究USP22是否与PD-L1相互作用。作者分别在HEK293FT和H157细胞中进行了免疫共沉淀分析，作者发现USP22与PD-L1相互作用。此外，免疫染色实验证实了Calu-1细胞的结果。因此，作者验证了USP22和PD-L1之间的相互作用。PD-L1由ECD（细胞外结构域）、TM（跨膜结构域）和ICD（细胞内结构域）组成。进一步分析表明，USP22的催化C端片段与PD-L1相互作用。此外，PD-L1 ICD结构域具有与USP22的结合能力。
研究结论：USP22对PD-L1的调节作用取决于它们的物理相互作用。
3.USP22调节癌细胞中PD-L1的去泛素化
鉴于USP22是一种去泛素化酶，作者想知道USP22是否调节PD-L1去泛素化。为此，作者在HEK293FT和H1299细胞中进行了co-IP实验。正如预期的那样，USP22显着降低了癌细胞中的PD-L1多泛素化。一致地，在USP22敲低后PD-L1多泛素化升高。值得注意的是，活性位点失活突变体USP22-C185A未能抑制PD-L1多泛素化而不影响其与PD-L1的相互作用。PD-L1的糖基化对于免疫抑制至关重要，作者探究PD-L1糖基化是否影响USP22诱导的PD-L1去泛素化。结果发现USP22抑制了糖基化和非糖基化PD-L1的泛素化。HRD1（也称为SYVN1）是一种E3泛素连接酶，参与内质网相关蛋白降解（ERAD）下PD-L1的泛素化和降解。作者想知道USP22和HRD之间的关系是否决定了PD-L1泛素化水平和降解。实际上，USP22减少了HRD1诱导的PD-L1泛素化并保护PD-L1免受HRD1介导的降解。
研究结论：USP22通过其去泛素化活性调节PD-L1蛋白的稳定性。
4.USP22与CSN5相互作用并使CSN5去泛素化
据报道，CSN5是PD-L1的去泛素化酶，作者想探究USP22和CSN5之间相互作用的兴趣。作者发现USP22敲低降低了CSN5蛋白水平而不影响CSN5 mRNA水平。一致地，USP22的异位表达上调了CSN5蛋白水平。然而，干扰CSN5表达对USP22蛋白水平没有影响。类似地，USP22敲低诱导CSN5的蛋白酶体降解。在使用放线菌酮(CHX)抑制蛋白质合成时，USP22敲低确实降低了CSN5蛋白质半衰期，而USP22过表达增强了CSN5稳定性。这些数据表明USP22稳定CSN5而CSN5不能影响USP22蛋白水平。
由于CSN5与PD-L1结合，作者想知道USP22是否与CSN5发生物理相互作用。实验结果表明USP22与CSN5外源性和内源性相互作用。免疫染色实验揭示了USP22和CSN5的共定位。此外，USP22可以去除CSN5的多聚泛素链，而CSN5似乎对USP22泛素化没有影响。与野生型USP22相比，催化失活的突变体USP22-C185A未能减少CSN5泛素化。作者还通过USP22用一系列泛素突变体对CSN5进行了彻底的去泛素化分析。与PD-L1类似，USP22移除了CSN5的K6、K11、K27、K29、K33、K63连接的泛素链。
研究结论：USP22与CSN5相互作用并通过其去泛素化活性稳定CSN5蛋白。
5.USP22与CSN5协调以调节PD-L1
作者已经证明USP22使CSN5去泛素化，同时先前的研究表明CSN5使PD-L1去泛素化，作者认为USP22可能通过USP22-CSN5-PD-L1轴调节PD-L1。因此，作者认为USP22通过两种方式调节PD-L1泛素化：第一，USP22直接去除PD-L1泛素化；第二，USP22通过USP22-CSN5-PD-L1轴调节CSN5并调节PD-L1泛素化。由于USP22和CSN5都可以与PD-L1结合并影响其泛素化，作者想知道USP22和CSN5之间存在什么关系来影响PD-L1稳定性。作者的结果表明CSN5增强了USP22和PD-L1之间的相互作用。此外，USP22还促进了CSN5和PD-L1之间的相互作用。这些数据表明，USP22和CSN5增强了PD-L1与其他药物的相互作用。然后，作者同时敲低了H1792细胞中的USP22和CSN5。作者发现与单独敲低相比，同时敲低USP22和CSN5进一步下调了PD-L1蛋白水平。
研究结论：USP22与CSN5协同调节PD-L1。
6.抑制Usp22可以抑制肿瘤发生
为了验证USP22在PD-L1调节中的作用，作者因此确定了细胞表面PD-L1的表达。USP22的敲低降低了膜PD-L1水平，如流式细胞术所揭示的。PD-L1作为免疫检查点来抑制细胞毒性T细胞介导的肿瘤杀伤，作者探究USP22敲低是否抑制了肿瘤发生。与MC38相比，B16-F10表现出更高的PD-L1水平。因此，作者选择B16-F10来验证USP22在PD-L1介导的免疫检查点阻断中的作用。稳定的USP22敲低B16-F10细胞显示CSN5和PD-L1表达降低。USP22敲低抑制了肿瘤发生而不改变小鼠体重。同时，在稳定的USP22敲低后，肿瘤体积和肿瘤重量显着减少。
研究结论：USP22调节PD-L1以抑制肿瘤发生。
7.USP22通过PD-L1增强免疫抑制
针对PD-L1和PD-1的免疫检查点阻断疗法(ICBT)在多种肿瘤类型中表现出突出的临床益处。因此，作者探究USP22是否影响由PD-L1-PD1轴引起的免疫抑制。为了进行T细胞介导的细胞杀伤试验，将淋巴细胞与荷瘤小鼠分离。在与用指定构建体转染的B16-F10细胞共培养之前，用伴刀豆球蛋白A(conA)刺激T细胞。作者发现USP22敲低增强了LDH释放，表明B16-F10细胞中T细胞介导的细胞杀伤升高，而同时异位表达PD-L1以某种方式恢复了这种效应。根据KMpoltter数据库，低USP22基因表达与肺癌患者更好的预后相关。USP22对PD-L1的调节可能部分解释了这种相关性。为了进一步验证USP22和PD-L1的病理相关性，作者使用免疫组织化学染色研究了USP22和PD-L1在241份人类非小细胞肺癌样本中的表达。在67个PD-L1高表达的标本中，有59.7%检测到USP22，而在174个PD-L1低表达的标本中只有37.9%检测到USP22。
研究结论：USP22可以作为提高基于ICBT的癌症治疗效率的靶标。
结论与讨论
在这里，作者确定USP22是PD-L1的新调节器。一方面，USP22可以通过去泛素化直接调节PD-L1的稳定性。另一方面，USP22通过USP22-CSN5-PD-L1轴调节PD-L1蛋白水平。此外，USP22敲低抑制了肿瘤发生并促进了T细胞的细胞毒性。此外，在人类非小细胞肺癌样本中,USP22表达与PD-L1表达呈正相关。作者确定了一种新的PD-L1调节器，并描述了USP22在PD-L1介导的免疫逃避中的重要作用。USP22作为靶标可能是ICBT的新治疗方案。
Thank you!
原文链接：
https://biosignaling.biomedcentral.com/articles/10.1186/s12964-020-00612-y
