腺病毒载体的构建

https://www.biomart.cn/specials/hanbio2013/article/49337 腺病毒载体构建流程

2013-03-18 09:58 来源：丁香园  

1. 基因调取与腺病毒穿梭质粒的构建

针对客户感兴趣的基因，从NCBI网站上得到目的基因CDS区信息并设计引物，从文库中调出基因，克隆至腺病毒系统穿梭载体（Pshuttle-CMV）。如需克隆的为基因突变体，则将基因克隆至穿梭载体后，行若干次点突变，至得到需要的突变体为止。

2. 腺病毒骨架质粒的同源重组

将携带目的基因片段的穿梭质粒线性化后与腺病毒大骨架质粒共转入在特定的大肠杆菌中进行同源重组，由于腺病毒骨架质粒是氨苄抗性，而与穿梭质粒同源重组后，氨苄抗性丢失，同时表达卡那霉素抗性，因此，通过抗性的变化可筛选出腺病毒载体骨架重组子，挑取重组子进行酶切鉴定，挑选酶切鉴定正确的克隆，进行下一步腺病毒载体的包装。

3. 腺病毒载体的包装与扩增

将筛选到的重组腺病毒运用脂质体法（LipoFiter，Hanbio公司）转染到293细胞中，由于腺病毒载体基因组中的早期基因E1缺失，利用带有E1 基因的293 细胞作为包装细胞，一至两周即可包装出E1缺失的腺病毒载体，通过倍比扩增，富集病毒颗粒。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100%的感染效率。

4. 构建流程图