杜鹃：今天介绍的是酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosome/YAC)。它是第一个真核细胞染色体型的人工染色体，也是人类人工染色体的“母亲”。

简介

       酵母人工染色体(YACs)是从酵母的DNA中提取的基因工程染色体，然后连接到细菌质粒。通过插入100-1000kb的大片段DNA，插入的序列可以被克隆，并使用一种称为染色体行走的过程进行物理映射。这是最初用于人类基因组计划的过程，但是由于稳定性问题，YACs被放弃使用细菌人工染色体(BAC)。从Rankin et al.、Strul et al.和Hsaio et al.的初步研究开始，固有脆弱的染色体通过发现必要的自主复制序列(ARS)而稳定；是Murray et al.在1983年利用这一数据描述的精制YAC。

        YAC的主要成分是酿酒酵母的ARS、着丝粒和端粒。此外，可选择的标记基因，如抗生素耐药性和可见的标记，被用来选择转化酵母细胞。没有这些序列，染色体在细胞外复制过程中就不会稳定，也就无法与没有载体的菌落区分开来。

构建过程

       YAC是用一个初始的环状DNA质粒构建的，通常用限制性内切酶将质粒切成线性DNA分子;然后用DNA连接酶将DNA序列或感兴趣的基因连接到线性化的DNA中，形成单个大的圆形DNA片段线性酵母人工染色体的基本生成可分为6个主要步骤：

        1.将可选择的标记连接到质粒载体：这允许有或没有标记基因的菌落的差异选择。一种抗生素抗性基因允许在大肠杆菌中通过拯救突变大肠杆菌在生长培养基中必要成分的存在下合成亮氨酸的能力来扩增和选择YAC载体。TRP1和URA3基因是其他可选择的标记。外源DNA的YAC载体克隆位点位于SUP4基因内。这种基因补偿了酵母宿主细胞中引起红色素积累的突变。宿主细胞通常是红色的，只有YAC转化的细胞会形成无色的菌落。将外源DNA片段克隆到YAC中会导致该基因的插入失活，从而恢复红色。因此，含有外源DNA片段的菌落呈红色

         2.为有丝分裂稳定性所必需的着丝粒序列的连接

         3.自主复制序列的连接(ARS)，为进行有丝分裂复制提供复制起点。这允许质粒在染色体外复制，但使质粒高度不稳定，并容易失去着丝粒序列。

        4.连接人工端粒序列，将环状质粒转化为线状DNA片段

         5.插入待扩增的DNA序列(最高1000kb)

         6.转换酵母菌菌落

酵母染色体III

        2014年3月，纽约大学(New York University)朗格尼医学中心(Langone Medical Centre)的杰夫·博凯(jeff boke)发表论文称，他的团队合成了酿酒酵母16条酵母染色体中的一条，即染色体III，并将其命名为synIII。这个过程包括用合成的版本替换原始染色体中的基因，然后合成完成的染色体被整合到酵母细胞中。它需要设计和创造273871对DNA碱基对——比原始染色体中的316667对少。

基因工程应用

        酵母表达载体，如YACs、yps(酵母整合质粒)和YEps(酵母外环质粒)，与细菌人工染色体(BACs)相比具有优势，因为它们可以用于表达需要翻译后修饰的真核蛋白。通过插入大的DNA片段，YACs可以被用来克隆和组装一个有机体的整个基因组通过将YAC插入酵母细胞中，它们可以作为线性人工染色体繁殖，并在此过程中克隆插入的DNA区域。这一过程完成后，可以使用两种方法来获得已排序的基因组或感兴趣的区域：

1.基因定位

2.染色体图谱绘制

        这是很重要的，因为它允许详细地绘制基因组的特定区域。整个人类染色体已经被检测过，如X染色体。通过该技术，科学家标记了许多遗传疾病和性状的遗传标记的位置。

人类基因组工程

       YACs明显不如BAC稳定，很容易产生“嵌合效应”：克隆DNA的序列实际上不是对应于单个基因组区域，而是对应于多个基因组区域。嵌合作用可能是由于多个基因组片段结合到单个YAC中，也可能是两个或多个YAC在同一宿主酵母细胞中转化后的重组嵌合的发生率可高达50%其他人为产物包括克隆区域片段的缺失和基因组片段的重排(如倒置)。在所有这些情况下，从YAC克隆中确定的序列与原始的自然序列不同，如果依赖克隆的信息，就会导致结果不一致和解释错误。由于这些问题，人类基因组计划最终放弃了YACs的使用，转而使用细菌人工染色体(BAC)，因为BAC的突变发生率非常低。除了稳定性问题，特别是相对频繁发生的嵌合事件，YACs在生成覆盖整个人类基因组的最小平铺路径时被证明是低效的。生成克隆库非常耗时。此外，由于在选择合适的克隆时依赖序列标记位点(STS)作为参考点的本质，存在很大的差距，需要进一步生成库来跨越。正是这个额外的障碍促使项目转而使用BACs的两个因素：

        1.BACs的生成速度要快得多，当生成冗余的克隆库时，这是必要的。

        2.BACs允许使用STSs进行更密集的覆盖，从而在硅胶中生成更完整、更有效的最小平铺路径。

       然而，这两种方法都是可行的，正如秀丽隐杆线虫(C. elegans)的基因组所证明的那样。大部分基因组都是由BACs拼接而成，而空白部分则由YACs填充。

人工染色体全家福