项目文章 | 基于单细胞和空间转录组学解码脐带华通胶来源间充质干细胞的异质性

2022年12月，福建医科大学附属协和医院陈小松教授、陈良万教授和福建医科大学陈敬华教授在 Advanced Science 杂志上发表了脐带华通胶来源间充质干细胞（WJ-MSCs）的相关研究，该成果也被编辑遴选为同期 Frontispiece 封面文章。福建医科大学附属协和医院整形外科与再生医学科陈鹏弘博士后、唐诗婕硕士、李铭副主任医师为第一作者。

本文通过单细胞和空间转录组测序对 WJ-MSCs 的特征进行了系统分析。该研究分析确定了 4 种 WJ-MSCs 亚群，即 proliferative_MSCs， niche-supporting_MSCs，metabolism-related_MSCs 和 biofunctional-type_MSCs，并进一步展示了这些亚群的转录组特征、细胞异质性和细胞发育轨迹。有趣的是，本研究中选择的 biofunctional-type_MSCs（S100A9， CD29 和 CD142）在体外和体内均表现出良好的伤口修复性能。整合空间组学数据后发现，S100A9+CD29+CD142+ 亚群在脐带的胎儿端富集，表明源自胎儿端的这个亚群有潜力发展成为一种伤口愈合治疗剂。总的来说，本研究全面描绘了 WJ-MSCs 的异质性，并为未来开发基于 WJ-MSCs 的药物提供了必要的资源。

科学问题

间充质干细胞（MSCs）的异质性是临床转化可重复、可预测和标准化治疗方法的障碍，传统 WJ-MSCs 治疗出现的不良临床结果和低重复性可能是由 WJ-MSCs 高度异质性导致的。此外，不同脐带（UC）区域的细胞之间也存在功能差异，这表明 WJ-MSC 空间异质性对临床治疗的也具有潜在重要性。因此，MSCs 的标准化和特定亚群的鉴定是促进临床转化的研究重点。利用单细胞和空间技术探索 WJ-MSCs 异质性将有助于建立准确的 MSC 分型和制定优势功能亚群的筛选方案。

研究思路

1、构建 WJ-MSC 单细胞转录组图谱

为了了解不同代 WJ-MSCs 的细胞多样性和转录特征，从 3 个人类 UCs 中分离出 WJ-MSCs 进行体外培养，然后从 P0 代和 P3 代收集细胞用于后续的 10x Genomics  scRNA-seq。6 个样本（huc_1P0、huc_1p3、huc 2P0、huc 2P3、huc_3P0 和 huc_3P3）总共得到 38125 个细胞进行下游分析。文章将所有细胞划分为 13 个细胞群，并根据标记基因表达情况鉴定出细胞类型，将其命名为"proliferative_MSC" （clusters 0, 2, 3, 7）、"niche-supporting MSC" （clusters 1, 4, 11）、"metabolism-related MSC" （clusters 5, 8, 12）、"biofunctional-type_MSC" （clusters 6, 9）。其中 Cluster 10 所占细胞比例较小，且与其他群缺乏功能相似性，因此从后续分析中删除。文章进一步通过免疫荧光分析证实了四个亚群的存在。

2、WJ-MSc 亚群的转录动态变化分析

文章分别对 P0 和 P3 样本进行了拟时间分析。结果表明细胞按照严格的时序发育。proliferative_MSCs 是轨迹的起点，并贯穿整个发育轨迹过程，而biofunctional-type_MSCs、 niche-supporting_MSCs和metabolism-related_MSCs 主要分布在终点。基因在时间轨迹上表现出两种主要趋势。其中包括逐渐上调的基因（模块 2、4、6）和逐渐下调的基因（模块 1、3、5）。COL3A1、FN1、FTH1、CoL1A1、DCN 和 MYL9 的表达呈上升趋势，在创面愈合、细胞-底物粘附、成纤维细胞增殖调控和氧水平反应中富集，而表达减少的基因则参与蛋白泛素化调控、有丝分裂细胞周期相转变、还有核分裂。这些数据进一步支持了 WJ-MSCs 在转录和发育上的异质性，并揭示了 WJ-MSCs 亚群之间的密切关系。

3、细胞间通讯网络分析

为了进一步描述 WJ-MSC 亚群之间的相互作用，使用 CellPhone DB 推断这些细胞之间的配体-受体相互作用。该分析显示，niche-supporting_MSCs 是最活跃的配体发送者，这表明这些细胞可能是维持细胞亚群良好稳态和功能特异性的基础。这些配体-受体对可能与 ECM 重建、组织发育、细胞内信号、血管生成和细胞增殖有关。

4、SCENIC 调控因子分析

根据四个 cluster 中代表性转录因子的表达模式，可以区分 WJ-MSC 亚型的身份，例如，biofunctional-type_MSCs 中 TP53 和 ELK3 活性升高，metabolism-related_MSCs 中 SP4、NFYA、HOXB7 和 SP2 活性上调，niche-supporting_MSCs 中 MAF、NFATC4 和 KLF9 活性升高，proliferative_MSCs 中 E2F2、E2F8 和 MYBL1 表达升高。这些数据表明多种转录因子的组合调控了 WJ-MSC 的发育并控制细胞功能维持异质性状态，这加深了我们对 WJ-MSc 功能异质性及其调控基础的理解。

5、揭示 WJ-MSc 亚型在 P3 和 P0 的不同转录特征

为了验证 scRNA-seq 数据，文章还对 P3 （n = 3）和 P0（n = 3）MSC 样本进行了 bulk RNA-seq 分析。结果发现，在 P3 和 P0 的 WJ-MSCs 中共筛选出 532 个上调基因和 695 个下调基因，表明 WJ- MSCs 在不同传代的显著异质性。TOP2A 是 bulk RNA-seq 中的一个上调基因，在所有四个亚群中广泛分布，表达量高，而 HIST1H4C 则没有变化，主要在 proliferative_MSCs 中。相反，CXCL 基因在 bulk RNA-seq 中表达下调，而在 niche-supporting_MSCs 中表达高。以上发现综合反映了 WJ-MSCs 细胞多样性和分子复杂性。

P3 和 P0 之间四种细胞类型的独特基因模式，使用基因集富集分析（GSEA）对差异进行全面研究。结果显示，proliferative_MSCs 具有与神经折叠形成相关的基因表达，niche-supporting_MSCs 优先参与有丝分裂姐妹染色粒分离，metabolism-related_MSCs 富集于线粒体翻译终止，biofunctional-type_MSCs 与维持端粒相关。此外，还探究了各亚群体中 P3 和 P0之 间的差异表达基因（DEGs）是否也受到独特的转录调控。

6、proliferative_MSCs 的异质性参与调控增殖活性

proliferative_MSCs 在 WJ-MSCs 中所占比例最大，除了其增殖潜力外，还确定了其他特定功能。Top 基因富集于与女性生殖发育、免疫调节和一氧化氮生物合成过程相关的通路。文章接下来探讨了 proliferative_MSCs（cluster 0、2、3和7）的异质性。其中，cluster 0 参与细胞周期过程，cluster 2 与染色体分离调控相关，DNA 复制显著富集在 cluster 3 中，cluster 7 涉及蛋白质异三聚化、氧转运和对转化生长因子 β 的响应。这些发现表明，proliferative_MSCs 是高度异质性的，由多个功能不同的细胞亚群组成。随后，通过拟时间分析探索其发展轨迹。总的来说，动态基因表达模式反映了它们在细胞生长和发育中的作用。

7、niche-supporting_MSCs  3 个亚群分析

niche-supporting_MSCs 分为三种不同类型子细胞群，胞吞和衰老的调控富集在 cluster 1，提示 cluster 1 可能介导细胞间通讯。cluster 4 中 DCN、COL3A1、COL14A1、LUM 表达富集，这些因素与胶原纤维组织、ECM 组织和组织重塑有关，这意味着为细胞发育提供了结构支持。cluster 11 显示富集的基因涉及生殖结构发育和活性氧代谢过程的正向调控。
接下来，检测 niche-supporting_MSCs 在 P3 和 P0 之间的差异。来自 P0 的 niche-supporting_MSCs 可能部分继承了 WJ 组织富含胶原蛋白的特性，而来自 P3 的 niche-supporting_MSCs 符合培养的 MSCs 的高增殖特征。文章进一步构建了这些细胞的转录轨迹，结果清楚地表明 P0 细胞沿各轨迹分布。相反，P3 细胞则集中在轨迹的左侧，这可能反映了在体外扩增过程中，niche-supporting_MSCs 亚群发生转化的不同阶段。分析结果显示 6 个基因模块，揭示了来自不同传代的 niche-supporting_MSCs 的不同细胞过程和功能转变。

8、biofunctional-type_MSCs 参与伤口愈合响应

结合单细胞数据分析和功能富集，发现 biofunctional-type_MSCs 是具有免疫调节和组织修复功能的主要功能亚群，高表达各种免疫调节和组织修复相关基因。
biofunctional-type_MSCs 分成了两种不同的 cluster（cluster 6 和 9）。cluster 9 中趋化因子水平增加，如 CXCL16、CXCL5、CXCL2 和 CXCL3，揭示了免疫调节治疗特性。功能富集分析也揭示了两个亚型之间不同的功能特征。此外，该亚群的 DEGs （P3 vs P0）主要参与血管生成。根据单细胞数据将 CD142、CD29 和 S100A9 确定为该亚群体的候选标记基因，用于后续分选实验。在体外实验实验中，S100A9+CD29+CD142+ 细胞可以增强创面愈合相关细胞增殖能力及迁移能力。在斑马鱼皮肤伤口模型中，S100A9+CD29+CD142+ 比“传统” WJ-MSCs 更能促进伤口愈合。这些数据也反映了 S100A9+CD29+CD142+ 可作为未来用于伤口修复的主要功能亚群。

9、WJ 区域异质性的空间比对

人脐带可分为三个区域：羊膜下区、WJ 区和血管周围区。不同功能的间充质干细胞可能存在于胶质性 WJ 的不同部位。为此，使用来自同一脐带不同部分的四个切片（huc_2 和 huc 3）进行了空间转录组分析（ST）：huc 2-maternal segment，huc_2-fetal segment，huc_3-maternal segment 和 huc_3-fetal segment。根据 4 个样本切片的聚类特异性标记基因，确定了定位于血管间隙的 WJ 源性肌成纤维细胞（WMF），由COL4A2 和 MYL6 标记；上皮细胞（KRT13、KRT5 和 KRT17）、内皮细胞（PECAM1、CD34、VWF 和 CDH5）和红细胞（HBA2、HBG2、HBA2 和 HBB）也被鉴定出来。DEG 结果显示，母体端和胎儿端存在不同的转录特征，母体端在 ECM 组织、细胞连接组织、粘附和 ECM 受体相互作用方面均有明显富集。相比之下，胎儿端富含与皮肤发育、表皮发育和参与免疫反应和血管生成调节的中性粒细胞激活相关的基因集，这表明该端是皮肤伤口愈合的关键 MSC 来源。

10、单细胞转录组和空间转录组联合分析

接下来，文章使用 SPOTlight 关联单细胞和空间数据集，以确定组织每个 spot 内每种细胞类型的百分比，并使用饼图进行可视化。结果表明，biofunctional-type_MSCs 亚群在胎儿端的比例高于母体端。此外，通过细胞类型之间的空间相互作用分析，探索两种不同细胞类型在同一 spot 出现的频率。来自同一供体的不同 UC 区域的细胞类型相互作用不同，同一 UC 区域在不同供体之间也存在不同的相互作用关系，体现了细胞的空间异质性。总的来说，结合 scRNA-seq 和 ST 分析揭示的细胞亚群的功能和空间分布之间的关系，对临床转化也有潜在的影响。

研究结论

总的来说，本研究绘制了第一个全面的 WJ-MSCs 大规模空间和单细胞转录组图谱，以破译 WJ-MSCs 的异质性，并从多角度阐明它们的结构。将间充质干细胞的分子特征与其功能联系起来是极具挑战性的。文章中的数据将成为未来类似研究的重要资源。值得注意的是，文章还发现了一个具有伤口修复能力的关键 WJ-MSC 亚群，并提示该亚群来自 UC 的胎儿段，可能具有理想的治疗效能。因此，这项研究提高了 WJ-MSC 亚群体作为资源的价值，促进了新的治疗策略的发展。这一信息对临床转化和药物开发具有重要意义。