利用腺相关病毒(AAV)研究目标基因功能的实验设计

根据之前自己的研究基础或文献查阅发现了一个感兴趣的基因，却不知道如何围绕这个基因开展后续的实验？不要发愁，小薇今天就为你带来一篇高分文献，了解一下此类情况实验应该如何设计和开展。

首先来一点背景介绍吧：腺相关病毒(AAV)是细小病毒家族的一员，可在临床试验和实验动物模型中用于感染人类。在人类临床试验中使用AAV载体进行基因治疗已显示出前景，因为AAV通常会引起非常温和的免疫反应和长期的基因转移。另外关于作者研究的目标基因也是他之前通过大量文献阅读发现的一个感兴趣的基因GlyRα1/3。

今天小薇要介绍的这篇文章利用AAV8在F11神经元细胞中转移GlyRα1/3基因，研究质粒腺相关病毒(pAAV)-GlyRα1/3对细胞毒性和PGE2介导的炎症反应的影响和作用。并对SD大鼠鞘内给药AAV-GlyRα3的缓解CFA诱导的炎症性疼痛的潜力进行了评估。这篇文章今天发表于Molecular Medicine，影响因子6.354分。

下面我们就来了解一下这篇文章是如何设计和实施的吧：

主要材料与方法

1. 准备F11细胞以及SD大鼠；

2. 实验目的及分组：研究pAAV-GlyRα1/3对F11神经元细胞系细胞毒性和PGE2调控的炎症反应的影响；大鼠分为4组: 鞘内注射AAV-GlyRα3加CFA组 (Gα3F组，n = 9); 鞘内注射AAV加CFA组 (GVF组，n = 6); 鞘内注射NaCl加CFA组 (GNF组，n = 9)；和正常对照组 (N组，n = 6)；

3. 构建pAAV- GlyRα1和pAAV-GlyRα3重组载体；

4. 将pAAV- GlyRα1和pAAV-GlyRα3分别转染至F11细胞中；

5. 检测细胞活力；

6. 检测病毒滴度；

7. 大鼠鞘内注射NaCl，AAV或AAV-GlyRα3，足底注射CFA；

8. 大鼠行为检测；

9. WB、免疫组化、ELISA等实验；

主要结果

1、pAAV/pAAV-GlyRα1/3转染不诱导细胞毒性。

用pAAV，pAAV-GlyRα1或pAAV-GlyRα3转染的细胞以及仅用Lipofectamine处理的细胞显著减少。pAAV，pAAVGlyRα1或pAAV-GlyRα3组的细胞活力低于Lipofectamine处理组。该发现表明，pAAV-，pAAV-GlyRα1-或pAAV-GlyRα3转染组的细胞活力下降是由Lipofectamine转染试剂引起的。但是，不能完全排除由pAAV，pAAV-GlyRα1或pAAV-GlyRα3转染引起的细胞毒性。

2、pAAV/pAAV-GlyRα1/3转染不诱导ERK磷酸化或ATF-3活化

1)PGE2给药和细胞收集用于测量ERK磷酸化和ATF-3的时间表显示在图1A中，在给药PGE2后30-60分钟ERK的磷酸化显著增加,而ATF-3未被激活 (图1B，D)。2) 用于测量ERK磷酸化和ATF-3活化的病毒转染和细胞收集的时间表显示在图1E中。Lipofectamine显著诱导ERK磷酸化 (图1F，G) 和ATF-3活化 (图1F，H)。3) 检查载体对F11细胞中PGE2-诱导的 ERK磷酸化的影响的时间表如图1I所示。发现PGE2给药诱导ERK磷酸化; 然而，预转染的pAAV-GlyRα3显著抑制了PGE2诱导的ERK磷酸化 (图1J，K)。（有没有发现图D没有误差线？想不到高分文献也有这种bug，不知道是忘了加还是压根儿就没做重复......）

3、阻断甘氨酸受体抑制PGE2诱导的ERK磷酸化

图2A显示了应用EP2-和甘氨酸受体拮抗剂pf-04418948和strychnine的时间表。结果表明，pf-04418948和strychnine下调PGE2-诱导的 ERK磷酸化，表明EP2和GlyRs对于PGE2-诱导的 ERK磷酸化是必不可少的 (图2B，C)。此外，在PGE2处理前30分钟施用的广谱PKC抑制剂G06983也导致PGE2-诱导的 ERK磷酸化的显著降低 (图2B，C)。

4、DRG中的神经元细胞毒性和ATF-3表达

图3A显示在鞘内注射AAV-GlyRα3进入SD大鼠后6周观察到GFP的表达，并在8周时在L5 DRGs中放大。双重免疫荧光染色显示GlyRα3和NeuN共定位在L5 DRG的神经元中 (图3A)。因此选择在鞘内注射NaCl，AAV或AAV-GlyRα3后8周给予CFA足底内注射。此外，与正常对照组相比，鞘内NaCl + CFA注射液(GNF组)、AAV + CFA注射液(GVF组)、AAV- GlyRα3 + CFA注射液(Gα3F组)明显上调了L5 DRGs中ATF-3的表达(图3B、C)。Gα3F组与GNF组比较发现，Gα3F组ATF-3的表达略有降低。鞘内给药AAV、AAV- glyr α3后，DRG神经元保持完整性；鞘内注射可引起轻微神经元损伤(图3B, C)。

5、鞘内注射AVV-GlyRα3可显着降低CFA诱导的炎性疼痛

在鞘内注射NaCl，AAV和AAV-GlyRα3组中，直到CFA后爪注射前两个月，对伤害性热刺激 (热痛觉过敏，图4A) 和机械刺激 (机械痛觉异常，图4B) 的后爪戒断反应与基线无显着差异。此观察结果表明，炎性疼痛不是由鞘内注射引起的。然而，此后不久，皮下足底CFA注射引起炎性疼痛，鞘内注射AAV-GlyRα3组持续两天，鞘内注射AAV，NaCl组在第四天恢复正常反应。但鞘内AAV-GlyRα3给药组 (Gα3F组) 疼痛明显减轻。与GNF组相比，无论热刺激还是机械刺激，疼痛都能持续三天 (图4，符号 *)。尽管在本研究中鞘内注射AAV后发现了轻度的疼痛缓解作用。然而，当将鞘内AAV-GlyRα3组与鞘内AAV组进行比较时，观察到缓解疼痛效果的显着差异 (图4，由符号 # 表示)。这些结果表明，在CFA诱导的大鼠模型中，鞘内注射AAV-GlyRα3可产生显着的镇痛作用。

6、AAV-GlyRα3抑制CFA诱导的大鼠DRG中的细胞因子激活

与正常对照组相比，GNF，GVF和Gα3F组显著诱导L5 DRG中的ERK激活 (图5A，B)。然而体内结果表明，当将GNF组与Gα3F组相比时，AAV-GlyRα3可以显着抑制DRG中的ERK磷酸化 (图5A，B)。用NeuN (图5C) 或GFAP (图5D) 对p-ERK进行双重免疫荧光标记显示，p-ERK可以位于DRG中的神经元 (图5C) 和卫星神经胶质细胞 (图5D) 中。然而，CFA诱导的p38磷酸化不被AAV-GlyRα3的鞘内给药所抑制 (图5E)。用p-p38和NeuN或p-p38和NF200双重免疫荧光标记显示p-p38在小神经元上表达 (图5F，G)。

7、AAV-GlyRα3抑制CFA诱导的大鼠DRG中的细胞因子激活

在体外研究了pAAV，pAAVGlyRα1和pAAV-GlyRα3对CFA诱导的F11细胞中细胞因子表达的影响。ELISA实验的时间表显示在图S5A中。TNF-α (图S5B) 、IL-1β (图S5C) 和IL-6 (图S5D) 在碳还原的F11细胞或用pAAV、pAAVGlyRα1或pAAV-GlyRα3转染的细胞中未诱导。在体内实验中，研究了AAV-GlyRα3在CFA诱导的神经元炎症中的潜在参与。结果显示AAV-GlyRα3基本上抑制了DRG中CFA诱导的TNF-α (图6A) 、IL-1β (图6B) 和IL-6 (图6C) 活化。

文章看似复杂，其实仔细拆解一下你就会发现作者主要做了两方面的研究：体外转染探究目标基因对细胞毒性、药物处理前后特定基因的磷酸化影响；体内实验转染探究目标基因对CFA诱导的大鼠的炎症情况以及细胞因子的影响。

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