【科研知识笔记】中药-肠吸收屏障评价体系

参考文献：从肠吸收屏障网络进行中药基础研究的思路及探索-谭晓斌，贾晓斌

•     口服是中药的主要用药方式，需要克服肠道吸收屏障网络作用，发挥其药效。综述了肠吸收屏障网络研究的技术方法体系，对完善这一体系并使之适宜于中药复杂体系的研究提出新的思路，建立适合于中药特点的肠吸收屏障网络研究技术平台。从肠吸收屏障网络角度，探讨中药炮制机制、中药复方配伍机制、中药与化学药联合用药对药物吸收的促进作用及其对生物利用度的影响，为研究中药组分胃肠渗透性，设计现代中药剂型提供依据。从肠吸收屏障网络研究中药，具有广阔的前景，必将推动中药现代化的进程。

1　口服给药途径吸收的肠道屏障

      影响药物吸收的主要肠道屏障包括化学屏障、物理屏障和生化屏障三大类。化学屏障主要由肠黏膜上皮分泌的黏液、消化液等构成,含有各种消化酶。蛋白类、多肽类和很多中药成分会被肠道化学屏障所破坏,如黄酮类化合物极易被乳糖酶根皮苷水解酶(lactase-phlorizin hydrdase,LPH)水解。物理屏障由结构、功能完整的肠黏膜上皮及覆盖于其表面的黏液构成。黏液层可有效地保护上皮细胞微绒毛免受机械、化学的损伤,同时也是药物吸收的障碍。而细胞膜和细胞间的紧密连接对药物的通透性则是限制药物吸收的主要因素。肠上皮细胞的代谢酶和药物外排泵构成生化屏障的重要部分。肠道上皮细胞内的众多代谢酶,如细胞色素酶以及葡萄糖醛酸转移酶等Ⅱ相代谢酶,可将已进入细胞的相应药物代谢,即体循环前代谢。P-糖蛋白(P-glycopro-tein,P-gp)、多药耐药相关蛋白(multidrug resist-ance-associated proterin,MRP)、甲氨喋呤(MTX)等外排系统能将细胞内的相应药物“泵”出细胞外,从而降低细胞内药物浓度[1]。

2　中药(复方)肠吸收屏障网络技术平台建设建立适宜于中药特点的肠吸收屏障网络作用的

   研究模型与技术,包括大鼠在体肠灌流模型、Caco-2细胞模型、肠肝微粒体模型等,从体内和体外两方面全面阐述药物的肠吸收过程及其变化。针对中药多成分的特点,选择多个与药效相关的,能代表中药组分理化特性(结合极性、溶解性和相对分子质量等)的主成分,研究其在肠吸收屏障的相互作用;考察处于中药多成分体系中的研究对象,在肠吸收屏障网络研究模型中的相互作用;探索建立符合中药多成分特点的渗透性评价数理模型。

    建立大鼠在体肠灌流模型[2,3]:  大鼠在体肠灌流模型保证了肠道神经以及内分泌输入的完好无损,同时也保证了血液及淋巴液的供应,提高了生物活性。采用单向灌流法,根据进、出口处灌流液中的药物浓度差考察药物在该肠段的吸收,其实验条件与口服给药后药物接触的肠道环境较接近,吸收速率稳定,与人体有良好的相关性[4]。该法既可从肠腔取样,又可从血液、胆汁中取样。同大鼠在体肠灌流相似,小鼠在体肠灌流对水流量(每厘米灌流肠段<0.5%)影响尽可能的

小,有利于小肠保持其活性;小鼠小肠的渗透性与大鼠相似,没有显著性差异;代谢和外排与大鼠一样具有位置特异性。因此,小鼠在体肠灌流模型具有与大鼠在体肠灌流模型一样的特点。同大鼠在体肠灌流模型相比,小鼠模型还具有其独特的优势:代谢外排模式与大鼠不同,如大鼠在体肠灌流模型未检测到硫酸化芒柄花黄素,而在小鼠在体肠灌流模型中可以测出,与Caco-2模型的结果相同,小鼠肠灌流模型研究黄酮的硫酸化和葡萄糖醛酸苷化与人类相近,优于大鼠肠灌流模型;小鼠基因组人类90%同源,而大鼠与人类基因的同源性为75%左右,目前以小鼠为模式动物,对其遗传学、发育生物学、肿瘤生物学、分子心血管学、代谢疾病和生物信息学等多个方向进行研

究,已经建立了小鼠乙基亚硝基脲(ENU)大规模诱变、转基因、基因剔除等功能基因组研究技术平台,培多种转基因和基因剔除小鼠,必将推动药物的胃肠转运和吸收代谢的研究。

   肠吸收屏障网络研究细胞模型: 许多化合物虽然在体内有较好的生理活性,但是缺乏合适的吸收性能而无法进入临床,因此对药物进行体内各种生物膜和屏障的预测试验可以减化复杂的实验,用较为简单的参数进行描述。用于研究药物吸收、转运与代谢机制的细胞模型有Caco-2、HT-9、MDK、LS174等,其中采用最多的细胞模型是人体结肠癌细胞———Caco-2模型。Caco-2细胞来源于人结肠癌细胞,与小肠上皮细胞近似。在传统的细胞培养条件下生长在聚碳酸酯膜上的Caco-2细胞达到融合并自发分化为肠上皮细胞,形成连续的单层,其形态学、标志酶的功能表达及渗透特征与小肠类似。Caco-2细胞模型在国外被广泛用于新药的

筛选及吸收机制的研究,2002年被国际认定为动物实验替代方法,已经被FDA批准。

      微粒体模型[6～8]:  该模型采用大鼠、小鼠、正常人微粒体以及大鼠、小鼠、人的肝癌、结肠癌微粒体等体外法,预示药物的代谢机制。微粒体法在模拟生理温度及生理环境条件进行生化反应,其酶制备技术简单,代谢过程快,结果重现性好,易大量操作,便于积累代谢样品供结构研究;同时,该方法可用于对药酶的抑制及体外代谢清除等方面的研究。将细胞中各亚细胞组分分离和纯化,对于深入研究外源化学物的靶位点、探讨化学物毒性效应的机制均十分重要。

例子：中药中的应用

    应用Caco-2细胞模型技术对中药复方羊藿三七进行细胞层次的吸收代谢研究;选用大鼠在体肠灌流模型对药物在不同肠段的吸收代谢进行研究;选用肝、肠微粒体对大鼠肝脏代谢、肠代谢进行研究。结果表明:复方羊藿三七片中黄酮苷类成分淫羊藿苷在肠道会受到LPH酶的水解作用和P-gp转运蛋白的外排作用,吸收受到阻碍。复方中另一类主要成分—三七中的皂苷类成分的吸收也较差。因此必须设计现代剂型,减少复方羊藿三七中黄酮类成分在胃肠道的代谢,克服肠吸收屏障网络的作用,改善黄酮类成分和三七皂苷类成分的膜转运来提高临床疗效。

    白芍药与青风藤配伍会有较好的抗炎和治疗关节炎效果,白芍中的芍药苷和青风藤中的青藤碱是各自主要的药效成分。通过实验,发现合用青藤碱可以显著改变芍药苷的药动学行为。进一步对芍药苷和青藤碱在肠道转运中的相互作用进行研究,发现P-gp抑制剂verapamil和quinidine,可分别增加芍药苷的吸收2.1倍和1.5倍;青藤碱显著增加芍药苷的小肠吸收,进而提高芍药苷的生物利用度,其机制可能是青藤碱可以减少P-gp介导的芍药苷外排[15～19]。

     Red Clover提取物作为食品添加剂在许多国家均有销售,含有与大豆相同的异黄酮类物质。在Red Clover中的主要异黄酮为biochanin A和for-mononetin,而异黄酮的生物利用度很低(一般小于5%)。在大鼠肠灌流模型中,formononetin的代谢物向肠腔和胆汁的最大排出速率高于biochanin A;使用Red Clover标准提取物的实验结果却表明biochanin A的代谢产物比formononetin多。在代谢研究中,大鼠肠、肝微粒体formononetin葡萄糖醛酸反应均比biochanin A快,而两种异黄酮在肠微粒体中葡萄糖醛酸化反应均比在肝微粒体中快。然而,不论在大鼠肠灌流模型还是在Caco-2细胞模型中,并没有见到如此多的代谢产物。在Caco-2细胞模型中两种异黄酮都被快速吸收和排泄。结合酶和转运载体共同控制药物的代谢产物通过肠和肝排出,并决定肠循环和肠肝循环对黄酮的处置的作用大小[20]。

例子：中药炮制的应用

    从肠吸收屏障网络作用的角度研究阐述中药炮制机制[9～14]:中药炮制是我国人民在数千年的医疗实践中不断总结、改进、发展形成的一套传统制药技术,与中药复方一起构成了祖医药学的两大鲜明特色。但是,目前对中药炮制机制的阐述只是停留在该过程的两端,即化学成分的变化和药理药效的变化,而对阐明炮制机制的关键环节———炮制前后中药活性成分的吸收等研究不够深入,对炮制机制阐述的过程中缺少一架沟通中药炮制前后化学成分变化与药理药效变化之间关系的桥梁———中药活性成分吸收代谢的研究。中药活性成分吸收与代谢是中药产生生物效应的重要环节,更是彻底阐述中药炮制机制的最佳切入点,为中药炮制机制的研究提供了新的思路与方法。

    淫羊藿Epimedium koreanumNakai.为传统补肾中药,淫羊藿黄酮在心血管系统、中枢神经系统、血液系统、免疫系统、抗炎、抗骨质疏松、抗衰老、抗肿瘤等方面的研究取得较大的进展。目前对淫羊藿的炮制研究主要有以下两个方面:(1)炮制前后黄酮类等化学成分的变化;(2)炮制前后药理、药效的变化。淫羊藿炮制品中总黄酮的量低于生品,且认为淫羊藿炮制后药效较生品有显著提高,而淫羊藿临床用药历代均以炮制品为主。单纯从淫羊藿炮制前后化学成分变化的角度并不能解释其炮制机制。选择淫羊藿,利用ADME/Tox平台研究其单体活性成分朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C、淫羊藿苷、宝藿苷Ⅰ的吸收、代谢机制与动力学及淫羊藿炮制品的标准提取物中这5个主要活性成分的吸收与代谢及其相互作用。根据研究结果,淫羊藿的炮制机制:淫羊藿所含黄酮苷的吸收代谢存在差异,次级糖苷的吸收大于多级糖苷(宝藿苷Ⅰ >淫羊藿苷>朝藿定A、B、C),加热炮制可以使淫羊藿主要活性黄酮的量发生变化,优选最佳的加热方法可以促使产生更多的易于吸收的生物活性黄酮(淫羊藿、宝藿苷Ⅰ),从而保证和提高了淫羊藿的疗效。