「青莲聚焦」优化整合新策略-组氨酸磷酸化蛋白质组学的无偏性鉴定

       组氨酸磷酸化(pHis)是一种罕见的磷酸化修饰，在细菌与低等真核生物的信号转导中起着关键作用，且已被证明参与了肿瘤的发生发展调控。与其他翻译后修饰类似，识别pHis需要从复杂的生物样本中富集磷酸化蛋白或pHis多肽，然后通过质谱测序。然而由于其化学不稳定性、亚化学计量特性与特异性富集试剂的缺乏，致使传统的磷酸化蛋白质组富集方法不适合探索pHis。

       近日，国家蛋白质科学中心（北京）应万涛课题组在分析化学专业杂志Analytical Chemistry在线发表题为“Integrated Strategy for Unbiased Profiling of the Histidine Phosphoproteome”的文章，对于实现组氨酸磷酸化蛋白质组学的无偏性鉴定建立了一个整合策略。

实验流程

实验结果

1、强阳离子交换（SCX）色谱法可以区分pHis肽和His肽

       在pH值为2.7的弱酸性溶液中pHis肽的电荷状态要低于His裸肽的电荷状态，这为在蛋白质组研究的进一步富集之前，通过利用强阳离子交换（SCX）色谱对pHis肽进行预富集奠定了理论基础。作者利用α-酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和人血清白蛋白(HSA)三种标准蛋白酶消化的肽混合物，建立了一个阶梯梯度来实现不同电荷的肽的分离。

       结果表明，阶梯式梯度实现了pHis肽和His肽的相对分离，在SCX分离过程中，pHis肽的磷酸基仍然保留。

 2、利用阶梯SCX梯度从HeLa裂解物中鉴定pHis肽

      作者从相同肽混合物的两个相同的等分进行轻(甲醛、L)和重(C13D2O、H)标记。将重标肽酸化(pH<2.5)，在60°C下加热2小时，以降低pHis水平，然后将两组通过优化的阶梯梯度混合分离。分别收集2+和3+区域对应的组分，进行酸处理。然后采用Cu-IDA技术对pHis肽选择性富集，并用LC-MS/MS对这些多肽进行测序。

       观察到F2（2+电荷区）和F3（3+电荷区）中约75%和0.87%的肽的净电荷为2+，表明SCX色谱的选择性有限。在F2和F3中共鉴定出414个肽，其中包括376个His和38个非His肽。结果发现，log2(F3/F2)在非His和pHis肽中的分布是不同的。根据作者的假设，预计F2和F3中的非His肽段具有相似的H/L比值，预期的log2(F3/F2)平均值为0。而pHis肽显示出更高的值，表明这些肽可能被组氨酸磷酸化。在4个生物重复中，3组重标肽和一组轻标肽用酸处理（表示为反向标记重复序列）。作者认为pHis肽的低丰度可能夸大了数据依赖获取的随机性。一旦在一个重复的F2和F3中验证了一个pHis肽，而在其他重复中验证了一个候选肽，只要F2或F3的比例符合上述特征，它将被认为是潜在的pHis肽。共有310个独特的潜在pHis肽，其中70.3%的pHis肽在至少两次测试中被鉴定出来。作者观察到，在正向和反向标记实验中，NME2 (NIIHGSDSVK)，GAPDH (AGAHLQGGAK)和DDB1(LPSFELLHK)肽的H/L比值均有显著差异。DDB1(LPSFELLHK)肽在4个生物学重复中通过抗pHis单克隆抗体富集方式在蛋白水平上被鉴定出来。

3、利用线性SCX梯度提高对pHis肽的高可靠识别

       当处理含有多个碱性氨基酸的肽时，由于错过缺失或存在多个组氨酸，阶梯梯度有局限性。在这种情况下，pHis肽的净电荷增加，保留时间会相应地向后移动。作者设计75min线性梯度，根据电荷的差异分离和去分离所有肽，优化工作流程。

       随着盐浓度的增加，已鉴定的His肽数量更多，与组氨酸吸收正电荷的增加预期一致。共鉴定出39519个肽，其中His肽22671个。最终结合两个线性复制和阶梯梯度结果，得到563个pHis肽(H=1)和249个pHis肽(H=2)，对应568个蛋白。为了确定具有两个组氨酸残基的多肽中修饰的特异性组氨酸，作者进行基序预测分析。结果表明pHis更倾向于疏水氨基酸，与之前的研究结果一致。作者提出的整合策略降低了数据库搜索中pHis位点不匹配的概率，并提供了更准确的磷酸化位点分配，此方法可以作为组氨酸磷酸化蛋白质组无偏覆盖的有效策略。

小结

       作者利用在pH 2.7的弱酸性溶液中pHis 肽相对于His裸肽的低电荷状态，使用强阳离子交换(SCX)色谱法区分pHis肽和His裸肽。其次，采用Cu-IDA技术对pHis肽选择性富集。最后，引入稳定同位素二甲基标记技术，保证pHis肽的高可靠识别。利用该整合策略，从Hela细胞中鉴定到563条不同的pHis肽 (H = 1)。基序分析表明，pHis肽具有一致的基序HxxK并偏好疏水氨基酸，覆盖了以往几种研究的结果。因此，该方法为揭示组氨酸磷酸化蛋白质组学和研究组氨酸磷酸化的生物学过程和功能提供了一个无偏而有效的工具。

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