去泛素酶USP7有助于脊柱和球状肌萎缩症的致病性

写在前面

        今天推荐的是由美国宾夕法尼亚州费城托马斯-杰斐逊大学西德尼-金梅尔医学院生物化学和分子生物学系在2021年1月4日发表于Journal of Clinical Investigation （IF：12.466，JCR 1区）的一篇文章，通讯作者是Diane E Merry教授，研究表明泛素酶USP7有助于脊柱和球状肌萎缩症的致病性。

研究背景

        多谷胺（polyglutamine，polyQ）疾病是一种破坏性的、缓慢进展的神经退行性疾病，由不同的、不相关的基因的编码区中的polyQ编码CAG重复序列的扩展引起。在脊髓和横纹肌萎缩症（SBMA）中，雄性激素受体（AR）内的polyQ扩增导致进行性神经肌肉毒性，其分子基础尚不清楚。

摘要部分

        利用定量蛋白质组学，作者确定了由polyQ扩展引起的AR相互作用组的变化。作者发现，去泛素酶USP7优先与polyQ扩展的AR相互作用，并且降低USP7的水平可以减少SBMA细胞模型中突变体AR的聚集和细胞毒性。此外，USP7敲除抑制了SBMA和脊髓小脑共济失调3型（SCA3）果蝇模型的疾病表型，USP7的单等位基因敲除改善了转基因SBMA小鼠的几种运动缺陷。USP7的过表达导致AR泛素化减少，表明USP7对AR有直接作用。利用定量蛋白质组学，作者确定了突变体AR上受USP7调控的泛素化赖氨酸残基。最后，作者发现，在亨廷顿病的基因敲入小鼠模型的纹状体和额叶皮层中，USP7也与突变的亨廷顿蛋白（HTT）发生不同程度的相互作用。总之，作者的发现揭示了USP7在SBMA的病理生理学中的关键作用，并表明在SCA3和亨廷顿病中也有类似的作用。

研究内容

1.野生型和polyQ扩增型AR的不偏推定量相互作用筛选       

        可溶性AR扩展的polyQ区可能会改变蛋白质的整体构象。因此，作者推测这种结构改变的AR可能会与蛋白质伙伴发生异常的相互作用，并且识别不同的polyQ扩展的AR相互作用组可以提供对SBMA中工作的致病机制的见解。

        因此，为了确定AR相互作用组的特征和该网络的polyQ扩展依赖性改变，作者采用了基于SILAC（细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记）的定量蛋白质组学分析，以确定PC12细胞中共同IP的结合蛋白。以诱导表达AR10Q或AR112Q表达的PC12细胞为工具，通过多层IP实验筛选，USP7被确定为与polyQ-expanded AR用两种抗体的优先相互作用者。

研究结论：通过基于SILAC（细胞培养中氨基酸的稳定同位素标记）的定量蛋白质组学分析USP7被确定为与polyQ-expanded AR用两种抗体的优先相互作用者。

2.USP7在体外和体内优先与polyQ扩展的AR互动

        作者对不同的AR相互作用组的分析确定了AR112Q和USP7之间强烈的相互作用。随后作者通过AR表达的PC12细胞裂解物的共同免疫沉淀物进行免疫印迹分析来验证这种优先的相互作用；这些实验证实，与AR10Q相比，USP7与AR112Q共同免疫沉淀的程度更高。

研究结论：AR-USP7复合物在细胞中的形成因AR蛋白中扩展的polyQ段而增强。     

        为了确定USP7是否在体内与polyQ扩展的AR相互作用，作者使用了SBMA转基因小鼠模型，该模型在朊病毒蛋白（PrP）启动子的控制下在中枢神经系统（CNS）中表达人类全长的polyQ扩展的AR（AR112Q）。作者从这个转基因品系的雄性大脑和脊髓制备的组织裂解液中免疫沉淀了USP7，并通过免疫印迹检测到多聚酶扩展的AR的共沉淀表明这些蛋白质在体内相互作用。

        为了进一步研究USP7与内源性突变体AR在体内的相互作用，作者在SBMA的基因敲入（KI）小鼠模型的脊髓切片中进行了PLA，在7个月大的雄性KI和WT运动神经元中观察到PLA点，证实AR/USP7的相互作用发生在体内运动神经元中的AR和USP7蛋白的内源性水平。

研究结论：USP7在体内与AR相互作用。

3.USP7与polyQ-expanded AR的可溶性形式相互作用

        以前的研究表明，AR112Q可以通过SDS-琼脂糖凝胶电泳被解析为由全长蛋白组成的可溶性、3B5H10反应性、缓慢迁移的集合体物种，以及由全长AR和N端AR片段组成的不溶性、快速迁移的物种。通过SDS-PAGE或SDS-琼脂糖对相同的USP7免疫沉淀物进行免疫印迹分析，发现USP7相关的AR112Q在SDS-PAGE上以单体形式迁移，在SDS-琼脂糖上以可溶性、缓慢迁移的形式迁移。此外，免疫荧光分析显示，USP7不与聚集的AR112Q的核内含物同位。

研究结论：USP7优先与可溶性多Q扩展的AR相互作用，而不与核内含物共同定位。

4.敲除USP7可以回补polyQ扩展的AR的毒性和聚集

        为了评估USP7和polyQexpanded AR之间的优先互动是否在细胞功能障碍中起作用，作者确定了USP7敲除对AR112Q聚集和细胞毒性的影响。研究发现，降低USP7的水平导致怀有核包涵体的细胞数量急剧下降（5-8倍），而不改变AR单体的稳态水平。此外，SDS-琼脂糖凝胶分析显示，相对于对照组，USP7的部分敲除减少了快速迁移物种的数量。这一结果的原因仍在调查中；然而，值得注意的是，在正常人类成纤维细胞中也有类似的观察，其中通过RNAi部分减少USP7的水平导致p53蛋白的不稳定，但接近完全丧失USP7却能稳定p53。作者推测，这种现象可能与USP7的反馈调节及其在分裂细胞中的蛋白稳定作用有关。

研究结论：在SBMA的一个细胞模型中，敲除USP7会减少polyQ扩展的AR聚集并增加AR的周转。

5.USP7的单倍体功能可以回补DHT诱导的细胞毒性

        降低USP7的水平可以回补DHT诱导的polyQ扩展的AR表达细胞的细胞毒性。这些结果表明，在polyQ扩展的AR表达细胞中，部分降低USP7的水平可以回补polyQ依赖的表型。作者还评估了USP7单倍体的充足性对这种体外表型的影响。来自AR112Q小鼠E13.5胚胎的初级运动神经元在用DHT处理时发生细胞死亡，而来自AR112Q表达的USP7单倍体不足的转基因小鼠（AR112Q/USP7+/-）的神经元则对这种效应不敏感。这些数据证实了USP7在SBMA运动神经元毒性中的重要作用。

研究结论：USP7在SBMA运动神经元毒性中具有重要作用。

6.USP7敲除可回补果蝇模型中的SBMA表型

        由于降低USP7的水平对SBMA的细胞模型有保护作用，作者接下来试图评估USP7在SBMA体内病理生理学中的作用。因此，作者使用了SBMA的果蝇模型，表达AR52Q的果蝇显示出一种眼睛表型，其特点是在含有DHT的饮食中长大，并在10天后成为成年人时，光感受器阵列从底层层膜上脱落。在DHT处理的第1天，对果蝇的分析没有发现明显的眼睛病变的迹象，确定在DHT处理的第10天观察到的效果不是发育缺陷的结果，而是DHT诱导的AR52Q病变的结果。为了确定USP7在这一表型中的作用，作者用两个不同的RNAi系敲除USP7。两个RNAi系都导致了AR52Q依赖性和DHT诱导的眼睛表型的回补，达到了与不表达AR52Q的果蝇相当的水平。这些数据确立了USP7在体内SBMA模型中介导多Q扩展的AR病理学的功能作用。

研究结论：敲除USP7可以回补SBMA果蝇模型中DHT引起的毒性。

7.USP7敲除可回补果蝇模型中的SCA3表型

        为了确定USP7是否在其他polyQ疾病的致病性中起作用，作者评估了USP7在脊髓小脑共济失调3型（SCA3）的果蝇模型中的作用。在这个模型中，携带77个谷氨酸的全长Ataxin-3与飞眼中的膜靶向GFP一起表达。作者使用了基于CD8-GFP的技术，它能使眼睛内部的变性可视化，而不需要进行组织学检测。随着光感受器的死亡，GFP信号减弱，导致整体荧光的减少以及马赛克的增加。作者选择用这种技术来研究USP7和其他DUBs及相关蛋白对致病性Ataxin-3 77Q引起的毒性的作用。Ataxin-3 77Q的表达导致了GFP表达的损失，表明了眼睛的退化。在对致病性Ataxin-3的毒性抑制剂的定向检测中，作者发现用于AR52Q的相同RNAi系敲除USP7导致变性表型的回补。因此，这些数据表明，SCA3的果蝇模型的表型回补并不是由于去泛素化功能的普遍丧失，而是由于USP7减少的一个特定后果。

研究结论：USP7可能在polyQ疾病的病理生理学中发挥广泛的作用。

8.USP7在转基因小鼠模型中改变了SBMA疾病的表型

        在SBMA的细胞和果蝇模型中观察到的降低USP7的细胞保护作用表明，在SBMA的转基因小鼠模型中，降低USP7水平可能会改善疾病表型和或减缓疾病进展。将USP7单倍体不足的SBMA转基因小鼠（AR112Q/USP7+/-）与USP7野生型（AR112Q）的相应SBMA小鼠以及两个对照组进行比较。(i) 非转基因（ntg，SBMA），但USP7单倍体不足（ntg/USP7+/-）；(ii) USP7和SBMA均为野生型（ntg）。AR112Q雄鼠越过12毫米横梁的速度明显慢于ntg和ntg/USP7+/-雄鼠。值得注意的是，在AR112Q小鼠中失去Usp7的一个等位基因（AR112Q/USP7+/-）后，该任务的表现明显改善。与AR112Q小鼠相比，AR112Q/USP7+/-在30周龄时显示出减少的紧握表型，这表明USP7的部分损失导致这一行为的明显改善。综合来看，作者的数据清楚地表明，降低USP7对SBMA转基因小鼠的行为表型有好处。

研究结论：在SBMA的小鼠模型中，USP7的单倍体功能可以回补一些运动障碍，并恢复脊髓运动神经元中未磷酸化的NF-H水平。

9.USP7促进AR的聚集

        USP7是一种泛在表达的蛋白质，具有泛素特异性蛋白酶的活性，并被认为与几种蛋白质的稳态水平的调节有关，包括Mdm2和p53。作者评估了USP7的一种催化非活性形式对PC12细胞中poly扩展的AR聚集的影响。为此，作者产生了表达AR112Q的PC12细胞系，该细胞系构成性地过度表达FLAG标记的野生型USP7或该蛋白的催化无活性（C223S）形式。作者观察到，USP7的过量表达导致携带AR包涵体的细胞比例大幅增加，USP7 C223S的表达导致AR112Q诱导的包裹体水平明显降低（相对于野生型USP7）。这些发现表明，USP7的去泛素酶活性与poly扩展的AR聚集有关。

研究结论：USP7的去泛素酶活性与polyQ扩展的AR聚集有关。

10.AR是USP7去泛素酶功能的底物

        为了确定USP7敲除是否会改变细胞中polyQ扩展的AR的泛素化状态，作者使用抗Ub和抗AR抗体进行了接近PLA试验。表达AR112Q的PC12细胞显示出PLA点，表明这些细胞中AR泛素化的稳态水平。通过稳定表达miR USP7 #1敲除USP7后，作者观察到每个细胞中拥有更多点状物的细胞比例有统计学意义的增加。这一发现表明，USP7的去泛素酶功能可以调节AR的泛素化状态。

        为了研究USP7去泛素酶功能对AR泛素化状态的生化影响，作者还通过瞬时转染HEK293T细胞，用表达（i）AR111Q（有N端核定位信号）、（ii）HA标记的Ub和（iii）FLAG标记的USP7或GFP对照的质粒来评估USP7依赖的AR泛素化。在这些细胞中过量表达USP7后，这种效应被削弱，这表明USP7直接对AR进行去泛素化。

        为了确定AR112Q上被USP7泛素化的赖氨酸残基，作者表征了USP7被敲除的细胞的全细胞泛素组。实验显示，在两个泛素组实验中，AR112Q上的8个赖氨酸残基在敲除USP7后显示出大于1.5倍的泛素化变化。

        为了确定防止由USP7调节的赖氨酸残基上的AR泛素化是否会影响其稳定性和聚集，作者将8个确定的赖氨酸之一突变为精氨酸。作者创建了表达AR107Q K17R和AR108Q K17R的克隆PC12细胞，并评估了K17R突变对poly-Q扩展AR聚集的作用。表达polyQ扩增的AR-K17R的细胞表现出更高频率的带有聚集AR的细胞。此外，这些细胞表现出增强的DHT依赖性的AR稳定，表明AR在赖氨酸17的泛素化在其降解中的重要作用。

研究结论：赖氨酸17是USP7的底物，支持USP7在赖氨酸17处对polyQ扩展的AR进行去泛素化的重要性。

结论与讨论

        作者设想由于polyQ扩展引起的AR相互作用网络变化将揭示对SBMA的病理生理学以及潜在治疗靶点的理解。在这篇文章中，作者确定了几种与野生型和polyQ扩增AR有差异的蛋白质。其中的一种具有差异的蛋白是USP7，它与polyQ扩增的AR优先发生相互作用。实验还表明USP7在SBMA细胞模型中介导DHT依赖性突变AR聚集和细胞毒性。不仅如此，在SBMA小鼠模型以及SBMA和脊髓小脑性共济失调3型(SCA3)的果蝇模型中，降低USP7会减弱这些影响并改善疾病表型，这表明这种去泛素化酶与polyQ疾病的发病机制有关。

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原文链接:https://www.jci.org/articles/view/134565