仿生型级联酶纳米反应器：用于肿瘤光疗、酶动力治疗和乏氧激活的化疗

A MXene-Based Bionic Cascaded-Enzyme Nanoreactor for Tumor Phototherapy/Enzyme Dynamic Therapy and Hypoxic Activated Chemotherapy

Xiaoge Zhang, Lili Cheng, Yao Lu, Junjie Tang, Qijun Lv, Xiaomei Chen, You Chen, Jie Liu*

Nano-Micro Letters (2022)14: 22

https://doi.org/10.1007/s40820-021-00761-w

本文亮点

1. 为阻断CD47免疫检查点，通过基因工程法构建了CD47过表达的肿瘤细胞膜，提高巨噬细胞介导的肿瘤细胞吞噬能力。

2. 提出了一种结合肿瘤酶动力学治疗、光疗和乏氧激活化疗的级联酶纳米反应器。

3. 葡萄糖氧化酶和氯过氧化物酶可以产生足够的HClO杀死常氧的肿瘤细胞，而替拉扎明则可以随后被激活杀死低氧的肿瘤细胞。

内容简介

中山大学生物医学工程学院刘杰课题组以Ti₃C₂纳米片为载体，通过化学键连接GOX和CPO，并负载乏氧敏感前药TPZ，制备级联酶纳米反应器Ti₃C₂-GOX-CPO/TPZ (TGCT)，最后将其包裹于高表达CD47的肿瘤细胞膜囊泡中(mₑTGCT)。由于高表达CD47仿生膜的包裹，mₑTGCT展现出优越的免疫逃逸能力和同源靶向能力，可以优先靶向至肿瘤部位并有效提高肿瘤细胞摄取。进入肿瘤细胞后，GOX和CPO可以通过级联反应产生大量的HClO，实现高效EDT。此外，额外的激光照射可以加快酶催化反应速率并进一步增加单线态氧(¹O₂)的生成，同时，光疗及EDT的耗氧可加重肿瘤内部缺氧状态，进而激活乏氧敏感前药替拉扎明(TPZ)实现化疗。体内外结果表明，mₑTGCT具有肿瘤光疗、EDT和化疗的放大协同治疗效果，可以有效抑制肿瘤生长。这种智能级联酶纳米反应器为实现同步和显著的抗肿瘤治疗提供了一个有前景的方法。

图文导读

I 高表达CD47肿瘤细胞的表征

采用基因工程法策略，利用慢病毒包载质粒对4T1肿瘤细胞进行基因转染，获得表面高表达CD47蛋白的4T1肿瘤细胞。如图1所示，激光共聚焦和流式结果都证明基因转染提高了4T1肿瘤细胞表面CD47的表达。

图1. (a) 肿瘤细胞表面CD47蛋白表达分布的CLSM图；(b, c) 肿瘤细胞表面CD47蛋白表达水平的流式定量图。(***p<0.001, n=3)

II 级联酶纳米反应器(meTGCT)的表征

本研究以块状Ti₃C₂为基体，通过液体剥离法制备得到Ti₃C₂纳米片，在其表面通过化学键结合葡萄糖氧化酶和氯化物过氧化物酶，之后负载化疗药物TPZ，并在其表面包裹高表达CD47蛋白的肿瘤细胞膜，获得级联酶纳米反应器mₑTGCT，并对其粒径电位等理化性质进行了表征(图2)。

图2. (a) 合成路线图；(b) 块状Ti₃C₂的EDS元素分布图；(c) Ti₃C₂纳米片的TEM图；(d) Ti₃C₂纳米片的AFM图；(e, f) 各组分的粒径和电位图；(g) XRD图。

III mₑTGCT体外酶催化活性表征

由于GOX可以在O₂条件下催化葡萄糖降解产生H₂O₂和葡萄糖酸，导致O₂消耗和pH降低，而HClO可以催化H₂O₂和Cl⁻产生HClO。因此，作者进一步研究了纳米反应器在体外酶催化活性。结果表明，相比于单一酶，级联酶能够有效地提高酶催化活性，且在激光照射下，温度升高也进一步增强了酶催化活性。

图3. (a, b) 各样品的PBS溶液(含4 mg/mL葡萄糖和25 mM Cl⁻)在有无635 nm激光(0.5 W/cm²)和808 nm激光(1.5 W/cm²)照射下的溶氧变化；(c) 各样品的PBS溶液(含4 mg/mL葡萄糖和25 mM Cl⁻)在有无635 nm激光和808 nm激光照射下的pH变化；(d) 各样品的PBS溶液(含4 mg/mL葡萄糖和25 mM Cl⁻)在有无635 nm激光和808 nm激光照射下的HClO产生量；(e) 不同浓度的meTGCT溶液(含4 mg/mL葡萄糖和25 mM Cl⁻)的HClO产生量；(f) 各样品的DPBF溶液在有无635 nm激光照射下的吸光度比值随时间的变化。(***p<0.001, **p<0.01 and *p<0.05, n=3)

IV mₑTGC的肿瘤细胞摄取研究

癌细胞膜包裹的纳米载体具有优先的同源靶向肿瘤能力。因此，本文使用荧光染料C6标记纳米反应器，通过共聚焦显微镜和流式细胞术检测肿瘤细胞对纳米反应器的摄取(图4a-c)。mₑTGC的细胞摄取效率较TGC高1.9倍，证明细胞膜包裹可以提高纳米反应器的肿瘤细胞靶向能力。

V mₑTGC的促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞

CD47高表达的mₑTGC通过竞争占据巨噬细胞表面的SIRPα，从而阻断巨噬细胞与肿瘤细胞之间的相互作用，增强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用。本研究分别用野生型细胞膜包裹的TGC (mwTGC)和mₑTGC预处理M1巨噬细胞2 h, 将其与mCherry标记4T1细胞共培养，通过激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测M1巨噬细胞吞噬4T1细胞能力(图4d-f)。与mwTGC处理组相比，mₑTGC处理后的巨噬细胞吞噬肿瘤细胞能力明显增强。

VI 肿瘤细胞内ROS检测

本文通过激光共聚焦显微镜检测4T1肿瘤细胞中ROS产生水平。与其他组相比，mₑTGCT在激光照射后产生ROS最多，证明mₑTGCT可以通过多种机制产生足够的ROS用于抗肿瘤治疗。

图4. (a) 4T1肿瘤细胞摄取mₑTGC/C6 4 h的激光共聚焦图；(b, c) 细胞摄取流式定量分析图；(d) 巨噬细胞吞噬4T1肿瘤细胞的激光共聚焦图；(e, f) 细胞吞噬流式定量分析图；(g) 4T1细胞中ROS水平的激光共聚焦图。(***p<0.001, **p<0.01, n=3)

VII 肿瘤细胞内乏氧检测

本文通过检测肿瘤细胞培养基里溶氧浓度变化，以及用乏氧探针抗体FITC-Mab1检测肿瘤细胞内乏氧状况。结果证明级联酶纳米反应器能够有效消耗细胞内O₂水平导致肿瘤细胞乏氧，从而有利于激活乏氧敏感前药TPZ。

VIII mₑTGCT体外抗肿瘤细胞评价

图5d-h结果显示，与其他治疗组相比，mₑTGCT在常氧和乏氧条件下对4T1肿瘤细胞的杀伤力最强。细胞活死染色和凋亡也显示mₑTGCT+激光照射处理细胞后的细胞死亡率显著高于其他组。

图5. (a) 不同样品处理4T1细胞后培养基里溶氧浓度随时间变化；(b, c) 4T1细胞乏氧水平的激光共聚焦图和流式定量分析图；(d-f) 不同样品处理4T1细胞24 h后的细胞存活率；(g) 不同样品处理4T1细胞的活死细胞染色图；(h) 4T1细胞凋亡图。(***p<0.001, **p<0.01，*p<0.05, n=5)

IX 体内荧光成像

本研究用荧光染料Cy5.5标记纳米反应器，通过小动物活体成像仪检测纳米反应器在体内的生物分布。图6结果表明，相比于其他组，mₑTGC/Cy5.5组展示了增强的肿瘤部位靶向能力及体内长循环性。

图6. 体内生物分布。(a, b) 不同样品在4T1荷瘤小鼠体内的荧光分布图和荧光强度定量分析；(c, d) 给药24 h后的各器官荧光分布图和荧光强度定量分析图；(e, f) 给药120 h后的各器官荧光分布图和荧光强度定量分析图；(g) 4T1荷瘤小鼠肿瘤部位在808 nm激光(1.5 W/cm²)照射下的温度变化。(***p<0.001, **p<0.01，n=3)

X 体内抗肿瘤评价

为评价mₑTGCT对4T1荷瘤小鼠肿瘤生长和存活率的影响，分别在第1和第7天给予荷瘤小鼠尾静脉注射两次纳米反应器。结果显示，mₑTGCT+激光照射治疗的肿瘤生长抑制效果显著高于其他治疗组，其中有两只小鼠的肿瘤得到完全消除，且各组小鼠体重变化无明显区别，证明该级联酶纳米反应器具有良好的生物安全性。

图7. 体内抗肿瘤作用。(a) 4T1荷瘤小鼠肿瘤治疗流程图；(b) 各组小鼠治疗期间相对肿瘤体积变化图；(c) 各组荷瘤小鼠肿瘤治疗期间体重变化图；(d) 各组小鼠治疗第31天后的瘤重定量图；(e) 治疗第31天时的小鼠和肿瘤组织照片；(f) 各组小鼠肿瘤组织TUNEL图。(与对照组相比，***p<0.001, **p<0.01 and *p<0.05具有显著性差异；###p<0.001, ##p<0.01, #p<0.05, n=5)

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